2021-12-31 修正: 挿入図表示の不具合を修正; crRNAスプリット別法のcrisp_bio記事へのリンクを追加
2021-12-30 初稿
[出典] "Efficient target cleavage by Type V Cas12a effectors programmed with split CRISPR RNA" Shebanova R, Nikitchina N [..] Severinov K, Entelis N, Mazunin I. Nucleic Acids Res. 2021-12-24.
https://doi.org/10.1093/nar/gkab1227

[背景]
 
 2021-12-31 6.58.27Cas12aシステムのcrRNAは5'末端側から3’末端側へと足場と標的DNAと相補的なスペーサで構成され,Cas12aタンパク質が相互作用する足場はシュードノット構造を取っている [*1; Figure 1 引用右図 A と C参照].

 これまでに,crRNAの5’末端を伸長することでAsCas12aによる哺乳類遺伝子編集効率が向上することが実証され [*2],これを利用して,トリガーRNAによって鎖置換を介して活性化されるスイッチングドメインを持つEscherichia coli のcrRNAを伸長することで,遺伝子発現の転写の転写制御が実現されていた [*3]. 一方で,足場そしてまたはスペーサーを短縮すると,FnCas12aおよびAsCas12aの切断活性が低下することが示されていた [*4, *5].また,FnCas12aのヌクレアーゼ活性がcrRNAの足場におけるヌクレオチドに依存することも示されていた[*4].

[成果] 

 Skolkovo Institute of Science and Technology (Moscow),utgers The State University of New Jersey, Institute of Physical Organic Chemistry (Belarus), University of Strasbourg and Centre National de la Recherche Scientifique, Kurchatov Genomics Center (Moscow)などの研究グループは今回,crRNAの足場部分の短縮が,Cas12aのin vitro 切断活性へ及ぼす影響は僅かであり,足場を削除しても (20ヌクレオチドのスペーサー部分のみであっても),切断活性が残存することを見出した. [Figure 1 引用右図 D 参照].

 さらに,AsCas12aが,足場部分とスペーサー部分に分割したスプリット型crRNAによっても,in vitro およびヒト細胞溶解液中にて,標的dsDNAの切断を効率的かつ特異的に切断することを確認した.また,AsCas12a-スプリット型crRNAが,この標的dsDNAの切断活性に加えて,標的ssDNAの切断と,トランスの非特異的ssDNA分解 (コラテラル活性)も発揮することを確認した.
 AsCas12aの他に,スプリット型crRNAとの組み合わせたFrancisella novicida (FnCas12a) およびLachnospiraceae bacterium (LbCas12a)由来のエフェクターも,AsCas12aと同様に機能することを確認した.

 スプリット型crRNAは,標的の効率的切断に,標準型のcrRNAより高濃度が必要になるが,単一の足場と複数のスペーサー部分を組み合わせたよりコンパクトなcRNAを利用可能になることから,Cas12aのコラテラル活性を利用したバイオセンサーによる単一チューブ多重診断ツールや同時並列診断ツールの向上に寄与することを期待できる.一方で,比較的短いRNAを安定に送達する工夫が必要にはなる.

[*] 引用文献とcrisp_bio記事
  1. "Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA" Yamano T, Nishimasu H [..] Zhang F, Nureki O. Cell 2016-04-21. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.04.003
  2. CRISPRメモ_2018/08/23 [第2項] crRNA 5'端の伸長によって、Cpf1の送達効率も編集効率も向上する.; "Extension of the crRNA enhances Cpf1 gene editing in vitro and in vivo" Park HM [..] Murthy N, Lee K. Nat Commun. 2018-08-17. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05641-3
  3. crisp_bio Cas12aの活性をgRNAの鎖置換回路を介してスイッチする.https://crisp-bio.blog.jp/archives/26265482.html; "Switching the activity of Cas12a using guide RNA strand displacement circuits" Oesinghaus L, Simmel FC. Nat Commun. 2019-05-07. https://doi.org/10.1038/s41467-019-09953-w
  4. 4. CRISPR関連文献メモ_2015/12/11 (Cpf1発見) https://crisp-bio.blog.jp/archives/2415467.html; "Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system" Zetsche B, Gootenberg JS [..] Zhang F. Cell. 2015-10-22. http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.09.038
  5. "Chemically Modified Cpf1-CRISPR RNAs Mediate Efficient Genome Editing in Mammalian Cells" McMahon MA. Prakash TP, Cleveland DW, Bennett CF, Radar M. Mol Ther 2018-03-06. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2018.02.031