[出典] "Mechanics of CRISPR-Cas12a and engineered variants on λ-DNA" Paul B, Chaubet L, Verver DE, Montoya G. Nucleic Acids Res. 2021-12-24. https://doi.org/10.1093/nar/gkab1272
CRISPR-Casシステムのエフェクターの中で，クラス2タイプVシステムに属するCas9が最も広く利用されてきた．しかし，その有効性と汎用性にもかかわらず，毒性および変異原性の可能性による限界も見えてきた [*1, *2]．そこで，新たなCRIPSR-Casシステムの探索や作出に関心が向き，近年，クラス2タイプVの他のメンバー (Cas12a, Cas12b, CasΦ, Cas12g, Cas14)の研究と利用が広がってきた
．
． University of CopenhagenとLUMICKSの研究グループは今回，張力を加えた標的DNAに対するヌクレアーゼ活性を解析することで，Cas12aの柔軟性を探った．λ-DNA上の標的部位を選択し，光ピンセットで張力を加えたDNAへの結合とホスホジエステル加水分解を，共焦点顕微鏡を介してリアルタイムで解析した [Figure 1引用右図参照]．
Cas12a野生型の場合 [Figure 7引用下図左参照]
強い張力 (HIGH FORCE)を加えることで，より非特異的 (promiscuous)になり，低い張力 (LOW FORCE)を加えた場合に標的特異的になる．
Cas12a変異型の場合
これまでのCas12aの構造機能解析から，リンカー (linker)，リッド (lid)およびフィンガー (finger)と呼ばれる3つの領域が，Cas12aの主要なキャビティーに沿って，crRNAとcrRNAの標的鎖 (TS)のハイブリッド形成を監視するチェックポイントネットワークを形成することが報告されている [*3のFigure 4 参照]．
- フィンガーの変異はCas12aを不溶化することから，リンカーとリッドに変異を導入し，生物医学や診断への応用の可能性を示唆する変異体を同定した [Figure 8引用右上図参照]：
- リンカーに変異を帯びた変異体のCas12a_M1は，crRNAに相補的なオリゴヌクレオチドで活性化後，無差別なssDNA切断活性だけを示した．
- リッドに二重の変異を帯びた変異体のCas12a_M2は，標的dsDNAを切断したが，無差別なssDNA分解活性は示さなかった．
- リッドに二重の変異を帯びた変異体Cas12a_M3は，標的dsDNAにニックを誘導した．
[参照論文とcrisp_bio記事]
- CRISPR-Cas9が誘導するDSBは，大規模な染色体短縮をもたらす．https://crisp-bio.blog.jp/archives/16180643.html; "CRISPR-Cas9 genome editing induces megabase-scale chromosomal truncations" Cullot G, Boutin J [..] Moreau-Gaudry F, Bedel A. Nat Commun. 2019-03-08. https://doi.org/10.1038/s41467-019-09006-2
- [20201212更新] ヒト胚CRISPR-Cas9遺伝子編集により染色体大混乱．https://crisp-bio.blog.jp/archives/23446874.html
- "Conformational Activation Promotes CRISPR-Cas12a Catalysis and Resetting of the Endonuclease Activity." Stella S, Mesa P [..] Hatzakis NS, Montoya G. Cell. 2018-11-29. https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.045
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