[出典] "Genome-wide detection of CRISPR editing in vivo using GUIDE-tag" Liang SQ, Liu P [..] Wolfe SA, Xue W. Nat Commun. 2022-01-21. https://doi.org/10.1038/s41467-022-28135-9
CRISPR-Casゲノム編集の臨床応用にあたっては，生体内でのオフターゲット編集をゲノムワイドで迅速に検出するツールが必要である．In vitro や培養細胞におけるオフターゲット編集の評価については実用的なツールが整ってきたが，生体内オフターゲット編集の評価ツールには，in vitro や培養細胞株での評価をベースとする間接的な評価であったり [*1]，DNA二重鎖切断 (DSB)修復因子のChIP解析 [*2] のように直接的であっても，煩雑で捕捉可能な時間が限られているといった課題があった．
[*1] "In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations" Akcakaya P, Bobbin ML [..] Maresca M, Joung JK. Nature 2018-09-20. https://doi.org/10.1038/s41586-018-0500-9; crisp_bio 2018-09-13 CRISPR-Casがin vivoで誘導するオフターゲット編集を高感度で同定可能とする手法VIVOを開発．https://crisp-bio.blog.jp/archives/12130728.html
CRISPR-Casがin vivoで誘導するオフターゲット編集を高感度で同定可能とする手法VIVOを開発
[*2] "Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-Seq" Wienert B, Wyman SK [..] Corn JE. Science 2019-04-19. https://doi.org/10.1126/science.aav9023; CRISPRメモ_2018/11/15 [第1項] DISCOVER-seq: CRISPRオフターゲット編集をin vivo で偏りなく検出する法．https://crisp-bio.blog.jp/archives/13564256.html
University of Massachusetts Medical Schoolの研究グループは今回，GUIDE-seq, DSB部位におけるドナーDNAの高濃度化を介したHDRの効率向上，および，Uni-Directional Targeted Sequencing (UDiTaS40) のライブラリー構築法を援用して，マウスの肝臓と肺におけるオフターゲット編集のワンステップ評価を実現したツール"GDUIDE-tag"を開発した．
SpyCas9-単量体ストレプトアビジン (mSA)およびdsDNAの組み合わせによるテザリングを介して [Fig. 1 右図 a 参照]，生体内でのDSB部位における標的DNA挿入の効率を向上させた．- さらに，UDiTaS40のライブラリー構築法を利用して，UMIを含むアダプターを組み込んでライブラリー構築の効率を高め，入力DNAを低減した．
- こうして構築したGUIDE-tagシステムを用いて，マウスの肝臓と肺のオフターゲット部位に誘発されたDSBにおいて，効率的なdsDNA捕捉を実現し，編集率が0.2%以上となる部位を捕捉することに成功した．
また，GUIDE-tagを補完するUDiTaS解析 [Fig. 2 引用右図参照] により，SpyCas9にプロミスキャスト・ガイドを組み合わせたことで生体内に誘導された新たなゲノム改変 (大規模欠失や転座)を検出した ．
GUIDE-tagは、オフターゲット編集部位をin vivoで直接かつ高感度に同定することができる。
コメント