[出典] "Reprogrammed tracrRNAs enable repurposing of RNAs as crRNAs and sequence-specific RNA biosensors" Liu Y, Pinto F, Wan X [..] Wang B. Nat Commun 2022-04-11. https://doi.org/10.1038/s41467-022-29604-x
 浙江大学やUniversity of Edinburghなどの中国・英国の研究グループが,タイプII CRISPRシステムにおいて,トランス作用型CRISPR RNA (tracrRNA)をリプログラムすることで,タイプII CRISPRシステムをベースにした新たなバイオセンサーを開発した.
  • タイプII CRISPRシステムのガイドRNA (gRNA)は,CRISPR RNA (crRNA)とハイブリッド化したtracrRNAからなり、どちらもガイドDNA標的機能に不可欠であり,これまで最も広く利用されているCRISPR-Cas9によるゲノム編集には,crRNAとtracrRNAを一体化した化学合成gRNA (synthetic gRNA: sgRNA)がもっぱら利用されている.
  • CRISPR-Cas9システムに対しては,その性能向上と機能拡張の観点から,主としてCas9の改変, sgRNAの改変と拡張といったリプログラムが盛んに試みられてきたが,tracrRNAのリプログラムも少なからず試みられてきた.例えば,2021年には,ドイツの研究グループが,細胞内RNAsの中にtracrRNAとハイリダイズするRNAs (non-canonical crRNAs: ncrRNAs)が存在することを発見し,リプログラムした(アンチリピート配列を改変した) tracrRNA (Rptr/ラプター)を関心のあるRNA (RNA-of-interest; ROI) とハイブリダイズさせることで,ROIを検出するシステムをLEOPARD (Leveraging Engineered tracrRNAs and On-target DNAs for PArallel RNA Detection)としてScience誌に発表した [*].
  • crRNA-tracrRNA 1中国・英国の研究グループは今回,dCas9をベースとするCRISPRaシステムにおいてcrRNA-tracrRNAペアリングのリプログラム可能性を系統的に探り,有効なリプログラムの原則を明らかにし,互いに直交するAND論理ゲートの開発に成功した [Fig. 1の一部引用右図参照].
  • また,先行したScience 論文にあるように,さまざまなRNAをcrRNAとしてハイジャックすることで, [Fig. 3参照 ] 大腸菌細胞の内在性mRNAやスモールRNAをCRISPRaを介して検出するRNAセンサーを開発した [Fig. 4参照 ].
 さらに,tracrRNAのリプログラムを介したCas9ヌクレアーゼをベースとするin vitro 核酸検出を可能とするAGATHA (Atypical gRNA-activated Transcription Halting Alarm)システムを開発した [Fig. 5引用右下図参照].crRNA-tracrRNA 5
  • このシステムは,AGATHA DNAと名付けたレポーターDNA,Broccpli (ブロッコリー)RNAアプタマーで発光する蛍光物質DFHBI,精製Cas9,および,in vitro T7発現システムで標的RNAを感知するために再プログラムしたtracrRNAで,構成されている.
  • AGATHA DNAは,3'末端の二次構造(アンチブロッコリーテール)によってブロックされた不活性なブロッコリーRNAアプタマーを発現し,標的RNAを感知すると,Cas9が活性化され,3'末端二次構造の転写が阻止され,DFHBIと結合できる機能的アプタマーを連続的に転写 [*]することで,蛍光出力信号が増幅される [* この仕組みが,Cas12やCas13が備えているトランス・レポーター核酸配列切断活性 (コラテラル活性)を介したシグナル増幅に相当する].
  • このAGATHAによってin vitroでのSARS-CoV-2の合成 RNA検出を実現した [右図 c/d参照].
[tracrRNAのリプログラム関連crisp_bio記事]
  • [*] 2021-04-28 LEOPARD: Cas9によるウイルス診断を,tracrRNAのリプログラムを介して実現 - 新型コロナウイルス変異株検出,多重化も可能.https://crisp-bio.blog.jp/archives/26220683.html; "Noncanonical crRNAs derived from host transcripts enable multiplexable RNA detection by Cas9" Jiao C, Sharma S, Dugar G [..] Sharma CM, Beisel CL. Science. 2021-04-27. https://doi.org/10.1126/science.abe7106