ヒトミトコンドリアDNAにおけるA-to-G変換を実現する塩基エディター"TALED"を構築 : crisp

[出典] "Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases" Cho SI [..] Kim JS. Cell 2022-04-25. https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.03.039; NEWS "A new era of mitochondrial genome editing has begun" Institute for Basic Science. 2022-04-16.

[著者所属] Institute for Basic Science (Daejeon), Seoul National University

　Jin-Soo Kimらは，DbCBE [*1,2]によるマウスミトコンドリアDNAnのC-to-T変換を報告していたが[*3]，今回，ヒトのミトコンドリアDNA (mtDNA)を対象とするA-to-G塩基変換を実現するエディターを開発し，TALED (transcription activator-like effector-linked deaminases)として発表した．

　ミトコンドリアには90種類を超える病因変異が知られているが，ミトコンドリアへガイドRNAをデリバリーすることができないため，これまでのCRISPR-Casシステムによる遺伝子修復が実現していなかった．

　その中で，2020年と2022年に，David R. Liuらが，"dCas9/Cas9nを必要としない塩基エディター 'DdCBE'の開発によりDNAのC•G-to-T•A変換" [*1]と”CRISPRエフェクターに依存しない塩基エディターDdCBEのミトコンドリアと核DNAに対する活性を向上し標的可能領域をTCから非TCサイトにまで拡大” [*1, 2]を実現していたが，A-to-G変換は実現されていなかった．

　今回開発されたTALEDは，TALE (transcription activator-like effector)，アデニンデアミナーゼTadA8e [*4]，およびDddAtox [*2]の３要素で構成されている．TALEはDNA配列を標的し，TadA8eは，LiuとDoudnaらが導出したA-to-G変換を促進するアデニンデアミナーゼであり，DddAtoxはLiuらが採用したB. cenocepacia由来のシチジンデアミナーゼ毒素であるが分割することで無毒化され (以下，sDddAtox)，TadA8eのDNAヘのアクセスを促進する．

　TALEDは，これまでssDNA特異的に作用するTadA8eが，dsDNAにも作用するようにしたことで成立した．著者らは，DddAtoxによってdsDNAを一過性に巻き戻すことで，dsDNAのストランドへのアクセスを可能にし，この間に，超速効性酵素であるTadA8eが必要な編集を実現すると，推定している．

[実証実験]

TALEDによって特定のmtDNA編集を含む単一細胞由来のクローンを作成した．
TALEDは，ヒト細胞において，様々なミトコンドリア遺伝子の合計17の標的部位で，最大49%の編集頻度でA-to-G変換を触媒した．
TALEDは，細胞毒性もmtDNAの不安定化も伴わなかった．
TALEDは，核DNAにオフターゲット編集を引き起こすことがなく，mtDNAにおけるオフターゲット編集もほとんど伴わなかった．

　研究グループは，植物の光合成に不可欠な遺伝子をコードする葉緑体DNAのA-to-G塩基編集に適したTALEDの開発も進めている．また今後，胚, 胎児, 新生児, および成人患者におけるmtDNAの病因変異修正を目指して，TALEDの編集効率と特異性をさらに高めていく．

[TALEDの構成など詳細]

TALEとTad8Are (以下，AD)の融合は，0.7% to 1.2%と低効率であるが有意なmtDNAのA-to-G変換を可能にした．この効率向上を目指して，DdCBE (TALEリピート+sDddAtox+UGIとUGI-sDddAtox-TALEリピートのペア)のUGIの一方をADに置き換えた(TALEリピート+sDddAtox+ADとUGI+sDddAtox+TALEリピート)"split TALED (sTALED) with UGI"を作出した．
C-to-T変換効率14%とともに，DdCBEでは実現されなかったA-to-G変換を18%の効率で実現した.
著者らは，"sTALED with UGI"に対してUGIフリーのsTALED (TALEリピート+sDddAtox+ADとsDddAtox+TALEリピート)によって，C-to-T変換を伴わずA-to-G変換をより高い効率で実現可能なことを示した．
著者らはさらに，無毒化した全長のDddAtox (E1347A DddAtox)を組み合わせcis に作用する単量体TALED (mTALED: TALEリピート+AD+DddAtox (R1347A)) とtransに作用させる二量体TALED (dTALED: TALEリピート+DddAtox (R1347A)とAD+TALEリピートのペア)を作出し，それらによるA-to-Gの変換を実証した．
mTALEDとdTALEDはともに，TALEに依存しないと思われるmtDNA D-ループにオフターゲット編集を誘発するがこれは低頻度であり，一定の特異性を示した．sDddAtoxを採用したsTALEDの場合完全長変異体ではなくスプリットDddAtoxを含むsTALEは、同じTALEアレイからなるmTALEDやdTALEDより一般的に効率が高かったが，特異性は劣った．
mTALEDをコードする遺伝子は，sTALEDやdTALED，DdCBEをコードする遺伝子 (5.3 kbp以上)と異なり，サイズが小さく ( 3.1∼3.5 kbp)，AAVによりデリバリーできることから，in vivo 遺伝子導入において大きな利点がある．さらに，TALEタンパク質が1つのmTALEDは，TALEタンパク質が2つのsTALEDやdTALEDよりも柔軟性があり，その結合部位には通常5′と3′の両末端にチミンが存在するが，3′末端のチミンは必須では無いことも，柔軟性を高める．

[*] 参考crisp_bio記事および論文