[出典] "High-throughput engineering of cytoplasmic- and nuclear-replicating large dsDNA viruses by CRISPR/Cas9" López-Muñoz AD, Rastrojo A, Martín R, Alcamí A. bioRxiv 2022-06-13 [プレプリント]. https://doi.org/10.1101/2022.06.13.495503 [著者所属] Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (Madrid)
大型の二本鎖 DNA (dsDNA)ウイルスの効率的かつ汎用的で信頼性の高いゲノム工学は，病原性/毒性の研究やワクチンベクターや腫瘍溶解性ウイルス作製に重要である．近年，CRISPR/Cas9をベースとするゲノム工学によって，ワクシニアウイルス (VACV)，ヘルペスウイルス，アフリカ豚熱ウイルス (ASFV)などの組み換えdsDNAウイルスが作出されている．しかし，目的とする遺伝子座のマーカーフリー組換え体をハイスループットに作製する堅牢かつ汎用的な方法はまだ報告されていない．
CRISPR/Cas9によるdsDNAウイルスゲノム工学では、組換え体の初期作製と親ウイルスのバックグラウンドからの選択という2つの重要なステップがある。López-Muñozらは今回、細胞質および核内で複製するdsDNAウイルスに対して、CRISPR/Cas9を用いて大規模な組換え体コレクションを生成するための最適なプロトコル"Two-Progenies method"を報告した。
細胞質・核内複製ウイルスのモデルとして、エクトロメリアウイルス (ECTV)と単純ヘルペスウイルス (HSV)の1型と2型 (HSV1型・2型)をそれぞれ使用した。本手法は、CRISPR/Cas9によるHDRを介した組換え体の効率的生成と、CRISPR/Cas9を介した親ウイルスとNHEJ修復過程からの産物を排除する選択を介して、効率的に目的とする組換え体のスクリーニングに要する時間と労力を軽減し、オフターゲットフリーのハイスループットな大量組換えDNAウイルスコレクションを、希望する遺伝子座に対して2時間以内に生成することを可能にする。
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