[背景]

　多細胞生物を対象としたCRISPR-Cas9 HDRを介したノックイン実験では、意図したノックインが実現した産物をスクリーンするために、2段階ノックインがますます普及している。この場合、本来のノックイン対象であるDNAエレメントとともに、選択用マーカーが挿入される。次に、然るべき産物を選択後、Cre/loxPまたはFlipase/FRTシステムを介した組換えによってマーカーを除去する。あるいは、CRISPRを介した方法で標識カセットを交換し、HDRを介して標識対立遺伝子を異なる対立遺伝子変異体と置き換える。

　さらに、PiggyBacを利用すると、1回の注入ステップのみで、シームレスなマーカー除去が可能である。ただし、このアプローチは、挿入点周辺に天然のTTAA部位が存在するか、そのような部位をde novoで工学的に作製するかに依存する。PiggyBacはまた、トランスポザーゼの標的発現を必要とし、目的外のゲノム位置に再統合されるリスクを伴う。

　近年、マイクロホモロジー依存性末端接合 (MMEJ) や一本鎖アニーリング (SSA) に基づくアプローチにより、培養細胞や蚊において、遺伝子座からマーカーをシームレスに除去することが可能になった。これらのアプローチでは、CRISPR-Cas9やSceIメガヌクレアーゼを利用してマーカーを標的とし、シームレスな切断を誘導するために、マーカーを挟むように小さな繰り返し（MMEJの場合は最大50bp、SSAの場合は約400bp）が挿入される。このアプローチは、培養細胞で点突然変異を起こしたり、蛍光タグを挿入したりするために採用されており、その効率は最大50％に達している。このアプローチでは、2回の遺伝子導入が必要であることが、実用上の課題になっている。また、脳のような高密度の組織を対象とした場合、組織内の明確なサブセットで内因性タグ付けをする必要がある。

　著者らは、ショウジョウバエにおいて迅速かつロバストにノックインを生成する2段階のアプローチを提案する。SEED (scarless editing by element deletion)/Harvestと名付けられたこの手法は、2つのステップともCRISPR-Casのみに依存している。SEED/HarvestはSSA修復経路を利用し、選択マーカーをシームレスに除去する。SEED/Harvestは、現在のタグ付け方法に代わる、迅速でロバストかつ低コストの方法を提供する。体細胞におけるSSAの高い効率は、Cas9の組織特異的発現を介した条件付き遺伝子標識も可能にする。

[設計]

　SSAは高度に保存された修復経路であり、反復配列がDSBを挟む場合に、他の修復経路よりも優先される。CRISPRをトリガーとするDNA修復によって、目的の遺伝子に選択マーカー (SEEDカセット)を組み込む [Developmental Cell 論文Figure 1引用右図 A 参照]。SEEDカセットは選択可能なマーカー（3xP3-dsRED）と、ゲノム上のどこにも切断部位を持たない2つのgRNA (図中のgRNA#1と#2）の標的配列で挟まれている。これらの部位を挟んで、挿入される外来配列は5′部分と3′部分 (右図 AのInsert 5'とInsert 3'0に分割され、100から400bpの繰り返し配列 (右図 AのRepeat) を共有する。

　SEEDカセットは、標的ゲノム挿入に必要な左右の相同性アーム (homology arm)で挟まれる。生体内でドナーの直鎖化を促すために、ゲノム切断 (DNA二本鎖切断/DSB)の生成に使用したgRNAの標的配列も、コンストラクト全体を挟むように付加する (右図 A の#3)。

　SEEDカセットの挿入とスクリーニングの後、スクリーニングマーカーは、その後のCRISPRをトリガーとする修復イベントによってシームレスに除去され、SSAによって解決される (右図 B 参照）。このステップでは、リピートがアニールし、その間の領域が除去され、その結果、3xP3-dsREDマーカーが傷跡 (スカー)を残すことなく除去され、最終的に目的の遺伝子編集が行われる（右図 C 参照) 。

　カセットの除去と選択を容易にするため、ユビキタスに発現するgRNA#1と#2、および生殖細胞駆動型Cas9（nos-Cas9、U6-gRNA#1+2）の両方を持つバランサー染色体を含むハエを作製し、以下「ハーベスター」と名付けた（右図 D 参照）。

　右図Eは、すぐに使えるSEEDプラスミドライブラリーの模式図である。3xP3-dsREDはgRNA1#と2#の標的配列で挟まれている。ノックインする配列は、左右の5′領域と3'領域へ分割され、リピートを含む意図された挿入によって挟まれている。