[出典] PROTOCOL "Optimization of specific RNA knockdown in mammalian cells with CRISPR-Cas13" Burris BJD [..] O'Connell MR. Methods 2022-08-17. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2022.08.007 [著者所属] University of Rochester.
Cas13ノックダウンの性能がプロトコルに依存して変動することを経験した研究チームが、ガイドRNAの性能と標的遺伝子のKDを繰り返しテストするための、より迅速で信頼性の高いプロトコルを示している。
- HEK293T細胞において、PspCas13bやRanCas13bと比較して、RfxCas13dが最大のRNA KDをもたらす。
- 様々なトランスフェクション条件を検討し、KD効率と細胞毒性のバランスをとる最適な条件を同定した。
- KD効率の分析方法を徹底的にテストし、RNA KDを正確に読み取るには、Cas13標的部位に対するqPCRアンプリコンの位置が重要なことを同定した。
- gRNAスペーサーの長さを長くすることで、非効率的なgRNAを利用することが可能になる。
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