[注] 反復的ゲノム編集 (iterative genome editing, IGE)
[出典] "Development and application of a rapid all-in-one plasmid CRISPR-Cas9 system for iterative genome editing in Bacillus subtilis " Zou Y, Qin L [..] Hu Y. Microb Cell Fact 2022-08-23. https://doi.org/10.1186/s12934-022-01896-0 [著者所属] Huazhong Agricultural University
IGEでは、反復ゲノム編集 (IGE)では、目的とする編集後にゲノム編集用プラスミドのレプリコンまたは耐性遺伝子を標的とするガイドRNAを介してそのプラスミドを効率的に除去 (cure)する手法が取られてきた。著者らは今回、Cas9 遺伝子発現カセットとプラスミドのレプリコンを標的とするgRNArepを発現するカセットの双方を組み込むことで [Fig. 1 参照]、ゲノム編集とプラスミド除去を兼ね備えたIGE用のオールインワンプラスミドを構築・実証した。
- 枯草菌において２種類の細胞外プロテアーゼの連続的ノックアウトを2.5日で実現可能なことを示した。
- このプラスミドは、Cas9 遺伝子発現カセットと、プラスミド のレプリコンを標的とする gRNArep を発現し、枯草菌において、単一遺伝子の欠失や点変異に対して100%の効率、遺伝子の挿入に対して96%の効率、プラスミド除去に対して90%以上の効率を達成した。
- 枯草菌の2種類の細胞外プロテアーゼ遺伝子eprとbprの連続的ノックアウト1ラウンドを2.5日で完了し、その上で、ドウチ繊維素溶解酵素DFE27を発現させ、その細胞外活性が159.5 FU/mLに達することを確認した。
- 本研究においては、PEG4000-assisted monomer plasmid ligation (PAMPL) 法による枯草菌の形質転換効率の大幅な向上も実現した。
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