[出典] "High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails" Shy BR [..] Marson Alexander. Nat Biotechnol 2022-08-25. https://doi.org/10.1038/s41587-022-01418-8 [著者所属] UCSF, Gladstone-UCSF Institute of Genomic Immunology, UC Berkeley, Paris City University, The Ohio State University, GenScript Biotech (China)
研究チームは最近、相同組み換え修復 (HDR)過程を利用するCRISPR/Cas9遺伝子ノックインの性能向上を目的として、二本鎖DNA (dsDNA) テンプレート (HDR templates, HDRTs)にCas9標的dsDNA (Cas9 target sequences, CTS)を組み込むことによってdsDNA HDRT (以下、dsCTSテンプレート)のノックイン効率を高め、エレクトロポレーションしたRNPのHDRTへの結合を介して、その送達を容易にする方法を開発した。その結果、ノックイン効率は大幅に向上したが、同時に細胞毒性も増加することがわかった。この毒性は、ポリグルタミン酸 (PGA)のようなアニオン性ポリマーを含めることで低減させることができ、ひいては細胞の収量を改善できるが、毒性を完全に除去することはできなかった。編集に成功した細胞の収量を改善することができるが、除去することはできない。
一本鎖DNA (ssDNA)は、dsDNAよりは毒性が低いことから、研究チームは今回、長いssDNAの両端にCTS部位を含む短いdsDNAの領域を結合するハイブリッドHDRT (以下、ssCTSテンプレート) [Fig. 1 参照]を開発した。
様々なサイズのコンストラクト、ゲノム遺伝子座、およびヒト初代T細胞のサブセット、B細胞、ナチュラルキラー (NK) 細胞、造血幹細胞を含むCD34+細胞など、臨床利用される細胞タイプについて、これらのssCTSテンプレートのノックイン効率および毒性を評価した。その結果、dsDNAテンプレートから、ノックイン効率と編集に成功した細胞の収量を平均２〜３倍程度向上させた。
さらに、初代ヒトT細胞におけるHDRを促進することが報告されている低分子のパネルを評価し、ssCTSテンプレートによるHDRをさらに促進するために働く最適な組み合わせと濃度を特定した。その結果、ノックイン効率をさらに約２〜３倍程度向上させ、ヒト初代細胞におけう80-90%のHDR効率を達成した。
こうして確立した手法を、メンデル遺伝性疾患に関わるIL2RA とCTLA4 変異のモデリングと遺伝子置換療法に適用し、その有効性を実証した。
さらに、ウイルスを使用しないCAR-T細胞製造のためのGMP適合プロセスを設計し、従来法を凌ぐノックイン効率46-62%と高収量 (> 1.5 x 10<9>細胞)を実現した。
[引用文献]
- Nguyen, D. N. et al. "Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency" Nat Biotechnol 2019-12-09. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31819258/
- Roth, T. L. et al. "Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting" Nature 2018-08-11. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29995861/
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