2023-02-23 Molecular Therapy 論文の書誌情報を追記
2022-09-21 bioRxiv 投稿に準拠した初稿
[出典] "Comparative analysis of CRISPR off-target activity discovery tools following ex vivo editing of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells" Cromer MK [..] Porteus MH.（bioRxiv 2022-09-10）Mol Ther 2023-02-14. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2023.02.011 [著者所属] UCSF, Stanford University, Integrated DNA Technologies.
2022-09-21 bioRxiv 投稿に準拠した初稿
[出典] "Comparative analysis of CRISPR off-target activity discovery tools following ex vivo editing of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells" Cromer MK [..] Porteus MH.（bioRxiv 2022-09-10）Mol Ther 2023-02-14. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2023.02.011 [著者所属] UCSF, Stanford University, Integrated DNA Technologies.
研究チームは、高忠実度の遺伝子編集に最適化した生体外編集法を利用してヒト初代細胞における種々のオフターゲット (off target, OT))評価法の直接比較を行った。
造血幹細胞・前駆細胞 (hematopoietic stem and progenitor cell, HSPC)の遺伝子編集を対象として、一般に利用可能なin silico ツール (COSMID, CCTop, Cas-OFFinder）および経験的手法 (CHANGE-Seq, CIRCLE-Seq, DISCOVER-Seq, GUIDE-Seq, SITE-Seq)を比較した。
- 11種類のガイドRNAとHiFi Cas9の複合体を用いてCD34+ HSPCを編集し、in silico および経験的手法で同定したさまざまな候補OT部位を含む~200サイトのパネルのターゲット・NGSを実行た。
- その結果、0.5%のインデルの検出限界で、gRNAあたり平均0.45のOTサイトを同定した。
- RNPとして送達すると、オンターゲット活性を損なうことなく、野生型Cas9と比較してHiFi Cas9の特異性が著しく向上した。
- 標準的な20nt gRNAを使用したすべてのHiFi Cas9 OTサイトは、一例 [*]を除いてすべてのOT検出方法によって識別された [* SITE-seqはAAVS1 gRNAによって生成されたOTを識別しなかった]。
- ほとんどのOT予測ツールで高い感度が得られた一方で、ほとんどのOT予測ツールが多数の偽陽性を出力したが、その中で、in silico ベースのCOSMIDと経験的メソッドのDISCOVER-SeqおよびGUIDE-Seqが、陽性予測において最も高性能であった。
- また、RNP複合体として送達された場合、in silico では特定されなかったOTサイトが、経験的手法で特定される例はなかった。
[Porteusチームからの関連論文とbioRxiv投稿]
- 2022-08-20 ウルトラ・ディープ・シーケンシングによるHSPCsのCRISPR/Cas9ゲノム編集の安全性検証 https://crisp-bio.blog.jp/archives/30021730.html ; "Ultra-deep sequencing validates safety of CRISPR/Cas9 genome editing in human hematopoietic stem and progenitor cells" Cromer MK, Barsan VV [..] Porteus MH. Nat Commun 2022-09-11. https://doi.org/10.1038/s41467-022-32233-z
- 2021-11-01 CRISPR-Cas9によるヒト造血幹細胞・前駆細胞のex vivoゲノム編集は，発癌性変異の導入や濃縮のリスクを伴わない https://crisp-bio.blog.jp/archives/27789946.html；"Ultra-deep sequencing reveals no evidence of oncogenic mutations or enrichment by ex vivo CRISPR/Cas9 genome editing in human hematopoietic stem and progenitor cells" Cromer MK, Basan VV [..] Porteus MH. bioRxiv. 2021-10-27 [プレプリント]. https://doi.org/10.1101/2021.10.27.466166
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