[注] HF-CBE (High-Fidelity CBE); STOP (コーディング遺伝子への未成熟終止コドン誘導を意味する)
[出典] "High-Fidelity Cytosine Base Editing in a GC-Rich Corynebacterium glutamicum with Reduced DNA Off-Target Editing Effects" Heo YB, Hwang GH, Kang SW, Bae S, Woo HM. Microbiol Spectr 2022-11-14. https://doi.org/10.1128/spectrum.03760-22 [著者所属] Sungkyunkwan U, Hanyang U, Seoul National U College of Medicine
ラットAPOBEC1をベースとするCBEは、標的遺伝子においてC:GからT:Aの一塩基変換を実現したが、CBEを構成するシチジンデアミナーゼが、sgRNAの配列の如何に関わらず、DNAと転写物であるRNAの双方にオフターゲット編集を誘発することが明らかにされ、高忠実度版CBE (HF-CBE) [*]が開発された。しかし、ゲノムワイドでのオフターゲット編集の詳細は詳らかにされておらず、微生物細胞工場開発へのCRISPRシステムによるゲノム編集の応用が広がってこなかった。
韓国の研究チームは、微生物細胞工場として知られるC. glutamicum の単一および多重遺伝子編集のために、DNAオフターゲット編集を全ゲノム配列解析により同定した [Fig. 1引用右図参照]。
- rAPOBEC1由来のCBEを介して、標的遺伝子に未成熟終止コドンを誘導することで、標的遺伝子を不活性化するCBE-STOP法を開発した [Fig. 1引用右図参照]。
- コハク酸生産を高めるために3遺伝子（ldh, idsA, pyc）の単一遺伝子不活性化株、および5遺伝子（ldh, actA, ackA, pqo, pta）を不活性化した株を複数作成した。
- これらの変異株を対象とする全ゲノム配列解析により、数十の一塩基変異（SNV）がゲノム中に誘導されていることを見いだした。さらに、オフターゲット変異の多くはCBEの非特異的DNAデアミナーゼ活性に由来することを見出した。
その上で、単一／多重ゲノム編集においてHF-CBE（YE1-BE3およびR132E-BE3）を利用することで、オフターゲット編集が著しく低減されることも明らかにした。
DNAオフターゲット解析とHF-CBE-STOPは、高い編集効率を持つマーカーレス遺伝子ツールを提供し、望ましくない変異を低減することにより、従来の遺伝子操作ツールよりも信頼性の高いCRISPR支援ゲノムエンジニアリングを促進することが可能である。
[*] HF-CBE関連crisp_bio記事
- 2020-05-26 CBEのオンターゲット活性を維持しつつDNAとRNAに対するオフターゲット編集を抑制. https://crisp-bio.blog.jp/archives/23097442.html；"A rationally engineered cytosine base editor retains high on-target activity while reducing both DNA and RNA off-target effects" Zuo E, Sun Y, Yuan T, He B, Zhou C [..] Li Y, Yang H. Nat Methods 2020-05-18. https://doi.org/10.1038/s41592-020-0832-x
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