[出典] "Identifying Anti-CRISPR Small Molecules via High-throughput Assay" Lim D, Sreekanth V, Choudhary A. Research Square 2022-11-17 [プレプリント]. https://doi.org/10.21203/rs.3.pex-1954/v1 [著者所属] Harvard Medical School, Harvard Medical School, Brigham and Women’s Hospital
[注] 2022年11月Nat Cell Biol 刊行論文 [＊]に対応するプロトコル論文
FRETをベースに構築したSpCas9の累積活性アッセイ（CAA）法を解説する。"CAA"は、CRISPR-Cas9システムが、PAMに結合し、構造を変化させ、標的および非標的鎖を切断するまでの触媒ステップの全てをアッセイ可能にする。
このアッセイは、DNA切断後にCas9が二本鎖DNA基質に結合する一方で、5′遠位非標的鎖がCas9に弱く保持され、過剰な相補的一本鎖DNAを介して変位しうるという観察に基づいている。CAAでは、DNA基質中の非標的鎖の5′末端をAlexa-Fluor 647で標識し、置換する一本鎖DNAの3′末端にクエンチャーを付加している。活性ヌクレアーゼによるDNA基質の切断後、過剰な一本鎖DNAが基質の3′鎖に勝って5′鎖にアニールし、蛍光を消光してSpCas9活性の光学的読み出しを提供する。したがって、Cas9を阻害する低分子が存在すると、高い蛍光シグナルが発生する。
このFRETアッセイは、多数の化学物質ライブラリーをテストするハイスループットスクリーニングに適している。
[関連crisp_bio記事]
- [＊] 2022-11-14 CRISPR-Casの活性制御に利用可能な細胞透過性低分子を探索するパイプラインを開発. https://crisp-bio.blog.jp/archives/30847491.html；"A general approach to identify cell-permeable and synthetic anti-CRISPR small molecules" Lim D, Zhou Q, Cox KJ, Law BK, Lee M [..] Church GM, Choudhary A. Nat Cell Biol 2022-11-17. https://doi.org/10.1038/s41556-022-01005-8
- 2022-02-21 細胞ベースのハイスループット・スクリーニングによるCas9に対する新規低分子阻害剤の同定と最適化. https://crisp-bio.blog.jp/archives/28694937.html；"Identification and Optimization of Novel Small-Molecule Cas9 Inhibitors by Cell-Based High-Throughput Screening" Lee S-W [..] Bach A, Sommer MOA. J Med Chem. 2022-02-10. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.1c01834
- 2021-03-04 [レビュー] 核酸をベースとする小型のCRISPR-Cas阻害剤の臨床応用へ向けて. https://crisp-bio.blog.jp/archives/25746114.html；REVIEW "Small Nucleic Acids and the Path to the Clinic for Anti-CRISPR" Barkau CL, O'Reilly D, Eddington SB, Damha MJ, Gagnon KT. Biochem Pharmacol 2021-02-26. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2021.114492
- 蛍光偏光法を利用したSpCas9活性アッセイ法を開発し、SpCas9の可逆的調節を可能とする低分子を同定. https://crisp-bio.blog.jp/archives/17434073.html；"A High-Throughput Platform to Identify Small-Molecule Inhibitors of CRISPR-Cas9" Maji B, Gangopadhyay SA, Lee M, Shi M, Wu P [..] Choudhary A. Cell. 2019-05-02. https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.04.009；グラフィカルアブストラクト
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