[出典] "PAM-independent ultra-specific activation of CRISPR-Cas12a via sticky-end dsDNA" Zhang W, Mu Y [..] Li L, Wang H, Xiao X. Nucleic Acids Res 2022-12-09. https://doi.org/10.1093/nar/gkac1144 [著者所属] Huazhong U Science and Technology, Sinopharm Genomics Technology Co., Yangtze Delta Region Institute of Tsinghua U, Life Health Care Clinical Laboratories (Beijing), Wuhan Polytechnic U.
標的dsDNA認識で活性化するCRISPR-Cas12aの非選択的ssDNAトランス切断活性 (コラテラル活性)を利用した高感度なバイオセンサーの研究開発が続いているが、その汎用性と特異性には不十分なところがあり、そのため応用範囲に限界があった。中国の研究チームは今回、
LbaCas12a（Lachnospiraceae bacterium Cas12a）の新たなターゲティング基質として、粘着末端（Sticky-End）領域を持つ2本鎖DNA（dsDNA）（PAM-SE+ dsDNA）を発見し、その活用を図った [Cas12aについて従来知られていた基質 (classical substrate DNA)と新たな基質 (novel substrate)について、Figure 1引用 AとFを参照]。
LbaCas12a（Lachnospiraceae bacterium Cas12a）の新たなターゲティング基質として、粘着末端（Sticky-End）領域を持つ2本鎖DNA（dsDNA）（PAM-SE+ dsDNA）を発見し、その活用を図った [Cas12aについて従来知られていた基質 (classical substrate DNA)と新たな基質 (novel substrate)について、Figure 1引用 AとFを参照]。- CRISPR-Cas12aが、新たな基質DNAに対して、その認識と切断にPAM配列を必要としないこと、基質の一塩基ミスマッチに対して高い感受性を示すこと、加えて、特殊な酵素特性を持つことを、発見した。
- さらにその分子機構の研究から、ガイドRNA（gRNA）が基質dsDNAと3本鎖のフラップ構造を形成していることを明らかにした [Figure 3 参照]。
- また、CRISPR-Cas12aが低温で活性化する特性も発見し、低温でのユニークなDNAハイブリダイゼーション動態と組み合わせることで、実試料での低濃度点変異検出を可能にする、一本鎖DNA（ssDNA）変換を必要とせず高速かつ簡便な完全なワークフローを構築することに成功した [Figure 4と Figure 5 参照]。
- 検出限界は合成鎖で0.005-0.01%、プラスミド・ゲノムDNAで0.01-0.05%であり、卵巣がんと肺がんに由来する28種類の臨床試料の変異検査結果は次世代シーケンサーの結果と一致した [Figure 6 参照 ]。
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