[出典] "New cuts for CRISPR effectors" Burgess DJ. Nat Rev Genet 2022-12-21. https://doi.org/10.1038/s41576-022-00570-w [著者所属] Nature Reviews Genetics
これまで、CRISPRシステムに由来するタンパク質の生物学的応用は、DNAやRNAの標的部位を切断するCRISPR関連ヌクレアーゼ（Casタンパク質）や、ヌクレアーゼ活性を欠損しつつ他の酵素活性を標的部位に誘導するdCas/nCasに焦点が当てきた。しかし、CRISPRシステムの進化的多様性の研究から、応用の可能性のある他の酵素活性が明らかになりつつある。Science 誌に掲載された2つの新しい研究は、CRISPRに関連するヌクレアーゼ-プロテアーゼ系の特徴を明らかにし、プログラム可能なプロテアーゼベースのRNAセンサーとして利用できることを示している。
加藤ら [*1]とStreckerら [*2]は、Desulfonema ishimotonii 由来のCas7-11の機能を明らかにした。これまでの研究から、Cas7-11は、推定Cas11ドメインと4つのCas7ドメインが融合して進化した単一タンパク質エフェクターであることが分かっていた。Cas7-11は、CRISPR RNA（crRNA）と結合すると、相補的な標的RNAに対してヌクレアーゼ活性を持つ。他種（Candidatus Scalindua brodae）のCas7-11は、その種のCsx29プロテアーゼに結合することが示されているが、Csx29プロテアーゼの基質や機能は不明であった。今回、加藤らとStreckerらは、D. ishimotonii から精製したCas7-11とCsx29タンパク質が複合体を形成することを確認した上で、Csx29プロテアーゼの基質の探索した。
機能的に関連するCRISPR構成要素は同じ遺伝子座にコードされていることが多いことから、両チームはまずcsx29-cas7-11のすぐ上流にコードされるタンパク質に対するプロテアーゼ活性を調べ、その結果、Cas7-11 crRNAに結合した標的RNAの存在下で、Csx29プロテアーゼが別のCRISPR関連タンパク質であるCsx30を切断することを発見した。両チームはクライオ電顕により再構成した構造から、標的RNAの結合がCas7-11-Csx29複合体の構造の再編成を引き起こし、Csx29活性部位をCsx30のタンパク質分解に適した状態にすることを明らかにした。
興味深いことに、両チームは、標的RNAは通常Cas7-11によって切断されるが、Cas7-11のヌクレアーゼ欠損変異体もまた、Csx30を介したタンパク質分解を引き起こすことを明らかにした。この結果は、Cas7-11-Csx29複合体のヌクレアーゼ機能とプロテアーゼ機能を切り離すことができることを意味し、将来的には、必ずしも標的RNAを分解せずにプロテアーゼ結合型RNAセンサーとしてCas7-11-Csx29を採用することができるようになると予想される。
標的RNAをトリガーとするCsx30切断の生物学的機能とは？
両チームは、Csx30が、近くにある別のタンパク質、シグマ転写因子CASP-σ（別名RpoE）と結合し、転写反応を媒介する可能性があることを示したが、両チームが提案したモデルは多少異なっている。Streckerらは、CASP-σ駆動のレポーター遺伝子を用いて、Csx30の切断がCASP-σの抑制を解除することを提案した。一方、加藤らは、膜結合型Csx30が切断されると、Csx30のN末端断片が細胞質に放出され、CASP-σと結合できるようになり、CASP-σの抑制が強まることを、タンパク質局在研究により提唱した。
両チームは、Csx30が、近くにある別のタンパク質、シグマ転写因子CASP-σ（別名RpoE）と結合し、転写反応を媒介する可能性があることを示したが、両チームが提案したモデルは多少異なっている。Streckerらは、CASP-σ駆動のレポーター遺伝子を用いて、Csx30の切断がCASP-σの抑制を解除することを提案した。一方、加藤らは、膜結合型Csx30が切断されると、Csx30のN末端断片が細胞質に放出され、CASP-σと結合できるようになり、CASP-σの抑制が強まることを、タンパク質局在研究により提唱した。
このRNAトリガープロテアーゼシステムの特徴を明らかにした後、研究チームは、このシステムを哺乳類細胞のRNAセンサーとして設計できるかどうかを検証した。Cas7-11-Csx29は、crRNA配列の存在下で、特定の標的RNAを検出するようにプログラム可能である。Streckerらは、CreリコンビナーゼをCsx30由来のリンカーを介して膜アンカーに繋いだものを含むいくつかのコンポーネントをマウス細胞で発現させた。標的RNAの存在下で、10％の細胞が、Csx30リンカーの切断によりCre依存性のレポーター遺伝子の発現を誘発した。加藤らは、ヒト細胞への応用において、Csx30リンカーをシトリン蛍光タンパク質とデグロン配列の間に配置した。標的RNAを供給すると、デグロンが他のタンパク質から分離し、シトリン蛍光が3倍高くなることを見出した。
CRISPRシステムは、主にウイルスRNAに対する防御機構として進化してきたことから、抗ウイルス性を有する転写応答（または他のシグナル伝達事象）が関与していると考えられ、今後の研究により、Cas7-11-Csx29プロテアーゼシステムの生理的役割を解明することが期待される。さらに、Cas7-11-Csx29システムをプログラム可能なRNAセンシングに応用する際の今後の展開として、感度向上のための最適化、応用範囲の多様化が考えられる。
[*] 引用crisp_bio記事と論文
[*] 引用crisp_bio記事と論文
- [20221104更新] タイプIII-E CRISPR-Casはヌクレアーゼ・プロテアーゼであり, 標的RNAを認識しタンパク質を切断し細胞増殖を停止する. https://crisp-bio.blog.jp/archives/30065282.html；"RNA-triggered protein cleavage and cell growth arrest by the type III-E CRISPR nuclease-protease" Kato J, Okazaki S, Schmitt-Ulms C, Jiang K [..] Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Nishimasu H. Science 2022-11-03. https://doi.org/10.1126/science.add7347
- 2022-11-04 タイプIII-E CRISPR関連プロテアーゼ (CASP)：CRISPR関連エンドペプチダーゼによるRNA活性化タンパク質切断. https://crisp-bio.blog.jp/archives/30697025.html；"RNA-activated protein cleavage with a CRISPR-associated endopeptidase" Strecker J, Demircioglu FE [..] Nishimasu H, Macrae RK, Zhang F. Science 2022-11-03. https://doi.org/10.1126/science.add7450
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