[注] OSCs（ovarian somatic sheath cells）
[出典] "CRISPR-Cas9 Genome Editing and Rapid Selection of Cell Pools" Stoyko D [..] Meng Q, Haase AD. Curr Protoc 2022-12-22. https://doi.org/10.1002/cpz1.624 [著者所属] NIDDK/NIH, NCI/NIH, U Patras.
CRISPR-Cas9システムにより、組織培養モデルを対象とする迅速かつ安価にゲノム編集が可能になったが、このアプローチは、単一の前駆細胞が新しい細胞プールへと拡大する"クローン増殖"のプロセスに依存していた。しかし、クローン増殖は、ショウジョウバエのOSCsのような非形質転換細胞培養モデルでは克服することが困難な技術的課題である。
OSCsは、PIWIタンパク質と結合する小分子RNA (piRNA: PIWI interacting RNA) によって生殖細胞ゲノムの完全性が保護されるエピジェネティック制御のユニークなex vivo モデルである。
著者らは、ショウジョウバエのOSCsを対象に、クローン選択を必要とせず、内因性タグ付きタンパク質や遺伝子ノックアウトを作製するプロトコルを提供した [＊]。
OSCsは、PIWIタンパク質と結合する小分子RNA (piRNA: PIWI interacting RNA) によって生殖細胞ゲノムの完全性が保護されるエピジェネティック制御のユニークなex vivo モデルである。
著者らは、ショウジョウバエのOSCsを対象に、クローン選択を必要とせず、内因性タグ付きタンパク質や遺伝子ノックアウトを作製するプロトコルを提供した [＊]。
- 基本プロトコール1：sgRNAプラスミドの設計とクローニング
- 基本プロトコール2：エピトープ・タギング用ドナーテンプレート・プラスミドの設計とクローニング
- 代替プロトコル：遺伝子ノックアウト用ドナーテンプレート・プラスミドの設計とクローニング
- 基本プロトコール3：トランスフェクションおよびゲノム編集細胞プールの選択
[＊] オリジナル論文
細胞プールの迅速な選択による内在性遺伝子の機能的編集（ショウジョウバエOSCsにおける細胞内標識遺伝子の迅速な作製）："Functional editing of endogenous genes through rapid selection of cell pools (Rapid generation of endogenously tagged genes in Drosophila ovarian somatic sheath cells)" Meng Q, Stoyko D [..] Hasse AD. Nucleic Acids Res 2022-05-27. https://doi.org/10.1093/nar/gkac448 [著者所属] NIDDK/NIH, U Patras, Johns Hopkins U.
ゲノム編集とエピトープタギングの組み合わせは、生理的な発現パターンを維持したまま、高い親和性と特異性を持つタンパク質の機能研究を可能とする強力な戦略である。しかし、クローン選択ができない細胞において、内在性遺伝子を安定的に改変することは困難であった。本論文では、非形質転換細胞培養モデルにおいて、内因性タグ付き対立遺伝子を安定的に生成するための簡便かつ迅速な方法を紹介する。
ショウジョウバエのOSCsにおけるpiwi の例では、この戦略によって、野生型タンパク質の発現レベルと細胞内局在をエミュレートするN末端タグ付きタンパク質を生成し、機能的なPiwi-piRNA複合体を形成することができることを明らかにした。さらに、ハエやヒトの細胞プールを迅速に選択し、内因性のN末端およびC末端タグ付きタンパク質やノックアウトアレルを樹立する簡潔なワークフローを提示した。
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