[注] Cas12f1の中でも小型のAcidibacillus sulfuroxidans 由来Cas12f1 (AsCas12f1) を利用
2024-03-16 プロトコル解説 (成書の1章) の書誌情報を以下に追記
"Single-Nucleotide Microbial Genome Editing Using CRISPR-Cas12a" Lee HJ, Lee SJ.  In: Braman JC (eds) Synthetic Biology. MIMB 2024-03-12.
https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3658-9_9
2023-01-04 初稿
[出典] "
Miniature CRISPR-Cas12f1-Mediated Single-Nucleotide Microbial Genome Editing Using 3'-Truncated sgRNA" Lee HJ, Kim HJ, Lee SJ. CRISPR J 2022-12-23. https://doi.org/10.1089/crispr.2022.0071 [著者所属] Chung-Ang U.

 微生物ゲノム編集では、CRISPR-Casシステムは、オリゴヌクレオチド誘発突然変異導入技術(Oligonucleotide-Directed Mutagenesis:ODM)によって作られた編集配列を残しつつ、編集されていない標的DNAを認識して切断し細胞死へと誘導するネガティブセレクションに利用される。

 韓国の研究チームは今回、Cas9に対してサイズが422 aaと小型なAsCas12f1 によるネガティブセレクションを介した大腸菌ゲノム編集の効率を評価するために、sgRNAプラスミドと1~4塩基の置換を誘発できる変異原性オリゴヌクレオチドを、AsCas12f1およびλ Betを発現させた大腸菌細胞にエレクトロポレーションした。
  • 二重、三重、四重の塩基置換は正確かつ効率的に実現したが、単一塩基置換の結果は不十分であった。
  • 単一塩基置換の改善を目指して、sgRNAの3'末端を連続的に切断し、Cas12f1の標的DNA切断活性を維持する最大切断量を決定し、この3'末端短縮sgRNAを利用することで、in vivo での効率的な1塩基編集細胞のネガティブセレクションを実現した。
  • さらに、サンガーシーケンスにより、微生物ゲノムの一塩基置換、挿入、欠失の精度が向上していることも確認された。
 これらの結果から、短縮型sgRNAのアプローチは、CRISPRを介した正確なゲノム編集に広く利用できることが実証された。
 
 [研究チームの先行研究論文]
 [Cas12f1関連crisp_bio記事]