[20230330更新] Cas12/13バイオセンサーの広がり（2） : crisp

[注] 2023年1月13日から、Cas12aに加えて、Cas12ファミリーとCas13ファミリーをベースとするCRISPRDxも本記事に集積；なお、従来のCRISPRDx記事には、エフェクターの種類の如何によらずタグ"CRISPRDx"を付してある；本記事は、「Cas12aバイオセンサーの広がり（1）」からの続き

2023-03-30
黄色ブドウ球菌およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）の高精度同定：Cas12aバイオセンサー
[出典] "Cas12a/Guide RNA-Based Platforms for Rapidly and Accurately Identifying Staphylococcus aureus and Methicillin-Resistant S. aureus " Cao X, Chang Y [..] Huang S, Zhang H. Microbiol Spectr. 2023-03-21. https://doi.org/10.1128/spectrum.04870-22 [著者所属] First Affiliated Hospital of Chongqing Medical U, Gansu Provincial Hospital.
　サーモヌクレアーゼ（nuc）遺伝子とmecA遺伝子を特異的な標的として、PCR、LAMP、RPAとCas12aバイオセンサーを組み合わせ、3つの増幅法の感度と特異性を比較し、最後に、111件の臨床分離株の蛍光読み出しを分析することで、各手法の臨床性能を検証した。結果の可視化とポイントオブケア検査を可能にするラテラルフローテストストリップ技術も活用した。

３種の前増幅法の中でLAMP法との組み合わせが最も有効であったことから、nuc-LAMP-Cas12a法とmecA-LAMP-Cas12a法を最適とした。
nuc-LAMP-Cas12aプラットフォームは10aM（～6コピー/μL）のLoDを示し、mecA-LAMP-Cas12aプラットフォームは1aM（～1コピー/μL）のLoDを示した。この両プラットフォームのLoDは、ゲノムDNAの4×10<3> fg/μLに相当した。1
臨床細菌分離株で効率を評価したところ、蛍光読み出しとラテラルフロー読み出しの双方で、100%の特異性と100%の感度を達成した。
本アッセイの総検出時間は、約80分（蛍光読み出し法）または85分（ストリップ読み出し法）であった。

　nuc-LAMP-Cas12aおよびmecA-LAMP-Cas12aプラットフォームは、黄色ブドウ球菌およびMRSAを迅速かつ正確に同定するための有望なツールであることが示されました。

2023-03-29-2
crisp_bio 2023-03-29 CRISPR-dCas9技術に分割型ルシフェラーゼの組み合わせて、暗中の感染を光らせる. https://crisp-bio.blog.jp/archives/31875492.html

2023-03-29-1
SARS-CoV-2検出感度向上：Cas12aバイオセンサーにおける多重gRNAの利用
[出典] "Multiplex gRNAs Synergically Enhance Detection of SARS-CoV-2 by CRISPR-Cas12a" Morales-Moreno MD [..] Hernandez-Garcia A. CRISPR J. 2023-03-21. https://doi.org/10.1089/crispr.2022.0074
[著者所属」National Autonomous University of Mexico
　メキシコの研究チームが、RT-LAMP前増幅とCas12aバイオセンサーによるウイルス検出にあたって、N遺伝子を標的とするgRNA一種類に替えて、二重または三重のgRNAsを利用すると、プローブの切断速度が4.5倍になり、検出感度も向上することを見出した。
　多重gRNAsの相乗効果を利用するこの手法によって、N遺伝子10コピーの検出が可能になり、蛍光測定とラテラルフローストリップによる検出をそれぞれ〜25分と〜45分で、陽性および陰性の臨床サンプルを100％正確に検出することに成功した。

2023-03-28
急性白血病スクリーニング：等温ワンポット型CRISPR-Cas12aバイオセンサーによるTdT活性の測定
[注] TdT（Terminal deoxynucleotidyl transferase/ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）；OPT-Cas（one-pot toolbox）
[出典] "A one-pot CRISPR-Cas12a-based toolbox enables determination of terminal deoxynucleotidyl transferase activity for acute leukemia screening" Yi M, Gong Y, Zhan Q [..] Gu B, Cheng W, Zhang D. Anal Chim Acta. 2023-03-20. https://doi.org/10.1016/j.aca.2023.341115；グラフィカルアブストラクト https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0003267023003367-ga1_lrg.jpg

　著者らは、TdT活性を高感度かつ選択的に測定するために、CRISPR-Cas12aのコラテラル活性に基づく等温ワンポット型ツールボックス（OPT-Casと呼ぶ）を開発した。

3′-ヒドロキシル（OH）末端を有するオリゴヌクレオチドプライマーをランダムに導入し、TdTによる伸長を行った。TdTの存在下、dTTPヌクレオチドがプライマーの3′末端で重合し、Cas12aタンパク質を同期的に活性化するトリガーとして機能する豊富なポリT-テールを生成した。
活性化したCas12aは、FAMとBHQ1の二重標識一本鎖DNA（ssDNA-FQ）レポーターをトランス切断し、著しく増幅した蛍光シグナルを発生させた。
プライマー、crRNA、Cas12aタンパク質、ssDNA-FQレポーターが1本のチューブに収めたこのOPT-Casは、1 × 10<-4> U/μL～1 × 10<-1> U/μLの濃度範囲でTdT活性を6.16 × 10<-5> U/μLという検出限界でシンプルかつ高い感度で定量でき、他のタンパク質との選択性についても極めて優れていた。
さらに、OPT-Casは、複雑なマトリックス中のTdTの検出や急性リンパ芽球性白血病細胞中のTdT活性の正確な測定に成功し、TdT関連疾患の診断への利用可能性を示した。

2023-03-25
crisp_bio別稿：CRISPR-Cas12/13を利用する核酸検出において、PAMフリーと多重化を実現.
FACT（Functionalized Amplification CRISPR Tracing）+ RePAIR（Reprogrammable PAIRing system）> FACTOR（FACT on RePAIR）https://crisp-bio.blog.jp/archives/31868682.html

2023-03-24
SARS-CoV-2 VOCの検出：。試薬の凍結乾燥とウイルス溶解をシングルステップのSHERLOCKアッセイに組み込み、化学添加剤でN遺伝子検出の感度向上
[出典] "CESSAT: A chemical additive-enhanced single-step accurate CRISPR/Cas13 testing system for field-deployable ultrasensitive detection and genotyping of SARS-CoV-2 variants of concern" Wang Y, Chen H [..] Dad E, Rong Z, Wang S. Biosens Bioelectron. 2023-03-20. https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115238 [著者所属] Bioinformatics Center of AMMS (Beijing); Hebei Medical U; Fig. 1 CESSATの模式図など https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S095656632300180X-gr1_lrg.jpg

1ステップのRT-RPAとCRISPR-Cas13aによるアッセイ法を、抽出不要のウイルス溶解と試薬凍結乾燥に組み込むことで、複雑なサンプル処理のステップと厳しい試薬保存条件を回避した。
化学添加剤として10%グリシンを添加することで、アッセイ感度を10倍に向上させ、検出限界 1コピー/μL（5コピー/反応）を達成した。
汎用性と多重標的の検出を考慮し、市販の8ストリップチューブに対応するスマートフォンベースの光ファイバー一体型ハンドヘルドデバイスを作製した。
SARS-CoV-2のジェノタイピングでは、8本のチューブを介して、NおよびS遺伝子、H60V70Del (アルファとオミクロン特異的)、K417N (ベータとオミクロン特異的)、H655Y (ガンマとオミクロン特異的)、T478K (デルタとオミクロン特異的)、49X (オミクロン特異的)、およびネガティブコントロール（NTC）の同時検出、および、SARS-CoV-2の合成シュードウイルスと5種類のVOCの特異的識別を、実現した。
意外にも、49Xは、特定の変異ではなく、Q493R、G496S、およびQ498Rに相当するcrRNA標的サイトであった。
40の臨床サンプルに対するジェノタイピング結果は、標準法であるqPCRアッセイと100％の一致を示した。

2023-03-19 =============
HPV-DNA (HPV-16, -18, -52)の多重検出：Cas12aコラテラル活性、DNA四面体、金属粒子プローブと誘導結合プラズマ質量分析法の組み合わせ
[注] 誘導結合プラズマ質量分析法 (inductively coupled plasma mass spectrometry: ICP-MS)
[出典] "DNA tetrahedron-based CRISPR bioassay for treble-self-amplified and multiplex HPV-DNA detection with elemental tagging" Zhan X, Zhou J [..] Lan F, Ying B, Wu Y. Biosens Bioelectron 2023-03-15. https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115229 [著者所属] Sichuan U.
　著者らは、標的DNAによって誘発されたCas12a/crRNAのトランス切断活性 (コラテラル活性)を介して、周囲の一本鎖DNA（ssDNA）リンカーが、金属ナノ粒子プローブ（197Au, 107Ag, 195Pt）がDNA四面体 (DNA Tetrahedron: DTN) 修飾磁気ビーズ（MBs-DTN）へと結合できない短いフラグメントへと切断され、その結果、ICP-MSのシグナルが明らかに変化することを示した。この読み出しと、空間的に分離したCRISPR Cas自己増殖戦略によって、HPV-DNAの検出限界218 fMと、1回の検査での多重アッセイを実現した。さらに、子宮頸部スワブ試料中のHPV-DNAを検出可能であり、その結果は、DNAシーケンシングからの結果と高い整合性を示した。

2023-03-18 =============
[レビュー] バクテリアの検査に向けた紙をベースとするセンサー
　CRISPRDxの読み出しには蛍光測定とともにペーパーをベースとするラテラルフローアッセイがよく組み合わせてある。Nature Reviews Bioengineeringから標題のレビューが刊行されたが、CRISPRDxについては、現時点では、「バクテリアのPOCTには不十分であるが、今後に期待する」という趣旨で取り上げられている [参照：crisp_bio 2023-03-18 バクテリアのPOCTにはペーパーセンサー ]

2023-03-16 =============
植物病原体の検出：RPA + CRISPR/Cas12a + RCA + フォトサーマルセンシング
[出典] "RPA-CRISPR/Cas12a Combined with Rolling Circle Amplification-Enriched DNAzyme: A Homogeneous Photothermal Sensing Strategy for Plant Pathogens" Liu Y [..] He Y. J Agric Food Chem 2023-03-09. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.2c07965 [著者所属] Southwest U, Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology Research；グラフィカルアブストラクト
　柑橘類で最も深刻な病気の一つである褐斑病と関連し、また、マイコトキシンを産生するAlternaria 属菌の検出；RCAプライマーをCRISPR/Cas12aのトランス開裂の基質として用い、RPA-CRISPR/Cas12aとRCA-enriched G-quadruplex/hemin DNAzymeという二つのシステムを組み合わせることで、標的DNAをfg/μLレベルの高特異度の検出を実現した。さらに、異なる果物や野菜のサンプルから培養したAlternaria や、現場で採取した柑橘類のサンプルの分析において、実用性を実証した。なお、この手法には高度な装置や複雑な洗浄工程は不要である。

2023-03-15 =============
SARS-CoV-2検出：CRISPR-Cas12aバイオセンサーの検出系としてSERSを採用し、ワンチューブ化したOVER-SARS-CoV-2 (One-Vessel Enhanced RNA test on SARS-CoV-2)を開発

[注] SERS（Surface-enhanced Raman scattering；表面増強ラマン散乱）
[出典] "A SERS-signalled, CRISPR/Cas-powered bioassay for amplification-free and anti-interference detection of SARS-CoV-2 in foods and environmental samples using a single tube-in-tube vessel" Ma L [..] Shen L, Man S. J Hazard Mater. 2023-03-11. https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2023.131195 [著者所属] Tianjin U Science & Technology, Affiliated Hospital of Hubei U Arts and Science；論文掲載図 Scheme 1参照
　標的核酸配列を認識したCas12aのトランス切断活性（コラテラル活性）の標的となるSERSナノプローブは、金ナノ粒子とラマン・レポーター分子および一本鎖DNA（ssDNA）プローブを結合させたものであり、その凝集-分散が、ssDNAのトランス開裂に左右される。
　また、反応容器を新たに設計することで、RNA逆転写、Cas12aトランス開裂、SERSナノプローブ架橋のステップを、ワンチューブに統合した。
　OVER-SARS-CoV-2によって、45分以内に前増幅なしで200コピー/mLのSARS-CoV-2を検出できることを実証した。さらに、臨床スワブサンプルでもその性能を確認し、複雑な環境および食品サンプルのシミュレーションも行った。

2023-03-11 =============

類鼻疽菌の検出：オールインワン・ワンポットRPA-Cas12aアッセイによる迅速可視化

[出典] "One-pot RPA-Cas12a assay for instant and visual detection of Burkholderia pseudomallei " Deng L, He X [..] Xiang Y. Anal Chim Acta. 2023-03-06. https://doi.org/10.1016/j.aca.2023.341059；グラフィカルアブストラクト

　RPA増幅とCas12aトランス切断を同時に進行させることで、スパイクした血液サンプルから〜30分以内に検出可能であり、検出限界は61.5 CFU/mLを達成し、One-Pot CRISPR-integrated assay for Instant and Visual Detection (OPC-IVD) として発表

2023-03-10 =============

サルモネラ遺伝子検出：RPA + CRISPR/Cas12システムのデジタルチップ化

[出典] "Adsorption-Free Self-Priming Direct Digital Dual-crRNA CRISPR/Cas12a-Assisted Chip for Ultrasensitive Detection of Pathogens" Xia L, Yin J [..] Mu Y. Anal Chem. 2023-03-03. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c05560 [著者所属] Zhejiang U City College, Zhejiang University City CollegeZhejiang University School of Medicine, Zhejiang U.

　RPA-CRISPR/Cas12システムは、迅速かつ高感度な病原体検出法のベースとして有望である。一方で、著者らが開発していたセルフプライミングデジタルPCRチップ（以下、チップ） [＊]は、核種検出のための強力なツールである。しかし、RPA-CRISPR/Cas12システムとチップの融合には、RPA-CRISPR/Cas12のタンパク質吸着と2段階の検出モードが障害となっていた。

　著者らは今回、吸着性のないチップを開発することで問題を解決し、病原体の超高感度検出を目的とするダイレクトデジタルデュアルcrRNAs（3D）アッセイを確立した。この3Dアッセイは、RPAの迅速増幅、Cas12aの特異的切断、デジタルPCRの正確な定量、マイクロ流体工学によるコンパクトな装置の利点を組み合わせ、POCT (Point of care testing) として利用可能なサルモネラ菌のデジタル絶対定量を実現した。

　本法は、サルモネラのinvA 遺伝子を標的とすることで、デジタルチップにおいて30分以内に2.58×10^1～2.58×10^4 cells/mLの範囲で、検出限界∼0.2 cells/mLの良好なサルモネラ検出の直線関係を達成した。さらに、このアッセイによって、核酸抽出を行うことなく、牛乳中のサルモネラを直接検出することが、可能になった。

[＊] Ying Muらの”セルフプライミングデジタルPCRチップ”先行研究論文

"A Self-Priming Digital Polymerase Chain Reaction Chip for Multiplex Genetic Analysis" Yin J [..] Mu Y. ACS Nano 2020-08-14.https://doi.org/10.1021/acsnano.0c04177

2023-03-09 =============

Maize chlorotic mottle virus (MCMV) の検出：RT-RAA + CRISPR-Cas12a + LFA
[注] LFA (Lateral Flow Assay)

[出典] "Portable rapid detection of maize chlorotic mottle virus using RT-RAA/CRISPR-Cas12a based lateral flow assay" Lei R [..] Zhang Y. Front Plant Sci 2023-03-03. https://doi.org/10.3389/fpls.2023.1088544 [著者所属] Institute of Plant Inspection and Quarantine, College of Plant Protection, College of Plant Protection (China Agricultural U)

　中国の研究チームが、アルカリ性PEGバッファーを用いた植物原料の全RNA粗抽出から始まり、室温（37~42℃）のポータブル金属インキュベーター上で実施可能な、一段階逆転写組換え増幅とCRISPR/Cas12aベースのラテラルフローアッセイを組み合わせた迅速検出手順を確立した。

　このワンチューブ式ワンステップRT-RAA/CRISPR-Cas12aラテラルフローアッセイは、MCMVのコートタンパク質の遺伝子を2.5コピー、MCMV感染トウモロコシ葉から抽出した全RNAを0.96pgと低濃度で検出可能である。さらに、MCMVに感染した5 dpiのトウモロコシの葉は、明らかな症状がないが、弱陽性として検出された。

2023-03-08 =============

p53遺伝子の検出：指数関数的増幅反応 (EXPAR) とCRISPR/Cas12に電気化学的検出法の組み合わせ

[出典] "Electrochemical detection of the p53 gene using exponential amplification reaction (EXPAR) and CRISPR/Cas12a reactions" Zhou S [..] Huo D, Hou C. Microchim Acta 2023-03-04. https://doi.org/10.1007/s00604-023-05642-0 [著者所属] Bioengineering College of Chongqing U, Three Gorges Hospital (Chongqing U), Sichuan U, SeNA Research Institute and Szostak-CDHT Large Nucleic Acids Institute；Scheme 1 参照

　本手法では、制限酵素BstNIを導入してp53遺伝子を特異的に同定・切断し、EXPARカスケード増幅の引き金となるプライマーを生成する。その後、CRISPR/Cas12aのコラテラル切断活性を活性化する増幅産物が多数得られる。この活性化されたコラテラル活性によって、ブロック・プローブが消化され、シグナルプローブが還元型酸化グラフェン修飾電極に捕捉され、電気化学シグナルが増強される。今回このシグナル・プローブを大量のメチレンブルー（MB）で標識することで、従来の標識法にもとづく電気化学シグナルを約15倍増幅することに成功した。

　この電気化学センサーは500 aMから10 pM、10 pMから1 nMの広い応答範囲を示すとともに、0.39 fMという蛍光検出よりも約1桁低い比較的低い検出限界を示すた。さらに、ヒト血清サンプルにおいて信頼性の高い判定結果をもたらした。
2023-03-07 =============

2023-03-07 [レビュー] CRISPR技術と懸念されるSARS-CoV-2変異株（VOCs）の検出と識別. https://crisp-bio.blog.jp/archives/31751187.html
2023-03-06 =============

SARS-CoV-2の迅速検出：超高感度かつ迅速なワンポット酵素触媒RCA支援CRISPR/FnCas12aアッセイ

[注] RCA (rolling circle amplification/ローリングサークルサークル増幅)

[出典] "An ultra-sensitive one-pot RNA-templated DNA ligation rolling circle amplification-assisted CRISPR/Cas12a detector assay for rapid detection of SARS-CoV-2" Zhu Z [..] Yang L. Biosens Bioelectron. 2023-03-01. https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115179 [所属機関] Shanghai Jiao Tong U, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical U, Zhuhai Huirui Biotechnology Co. Ltd

　著者が開発したOPERATOR (One-Pot Enzyme-catalyzed RCA-assisted CRISPR/FnCas12a detector assay for coronavirus SARS-CoV-2 detection)では、PAM配列と標的RNAに相補的な配列を含む一本鎖パドロック（PadLock）DNAを用い、RNAをテンプレートとするDNAライゲーションと多重プライミングRCA（multiply-primed RCA: MRCA）にって、ゲノムRNAをDNAに変換し増幅させ、一本鎖DNAのMRCAアンプリコンが、FnCas12a/crRNA複合体によって切断され、蛍光シグナルリーダーまたはラテラルフローストリップ（LFS）で検出される。 [Fig. 1. The principle and workflow of OPERATOR. 参照] 。

　OPERATORは、超高感度（1.625コピー/反応）、高特異性（100％）、高速反応（約30分）、簡単操作、低コスト、その場での可視化などの優れた利点を有している。OPERATORはまた、他の複雑なRNA、DNAウイルス、マイクロRNA、循環腫瘍DNAの分析にも展開可能である。

2023-03-05 =============

[レビュー] 金ナノ材料とCRISPR-Casシステムをベースとするバイオセンシング

[出典] REVIEW "Gold Nanomaterials‐Implemented CRISPR‐Cas Systems for Biosensing" Fu R, Xianyu Y. Small. 2023-02-25. https://doi.org/10.1002/smll.202300057 [著者所属] Zhejiang U

　Cas9、Cas12、Cas13などのエフェクターを擁するCRISPR-Casシステムは、標的配列を認識した後、シス切断またはトランス切断の活性を示し、この切断活性を利用することで、タグ付き核酸を分解して検出可能なシグナルを生成するバイオセンサーを設計することができる。

　CRISPR-Casを用いたバイオセンサーでは、ポイントオブケアでの検出や多様な信号の読み出しの要求に応えるため、高い消衰係数、容易な表面機能化、生体適合性などの優れた特性を持つ金ナノ粒子、金ナノロッド、金ナノスターなどの金ナノ材料が高頻度で実装されている。

　本レビューでは、金ナノ材料が実装されたCRISPR-Casベースのバイオセンサーの現在の進歩、特にこれらのバイオセンサーの動作メカニズムや性能に、焦点を当てる。CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a、CRISPR-Cas13aを含むCRISPR-Casシステムについて論じ、ハイライトする。また、金ナノ材料とCRISPR-Casシステムに基づくバイオセンシング戦略の展望と課題についても議論する。

2023-03-04 =============

薬剤耐性菌の検出：Cas12aによるシグナル増幅に、Au–Fe3O4ナノザイムのペルオキシダーゼ性を介した可視化を組み合わせてスマホで判定

[出典] "Au–Fe3O4 nanozyme coupled with CRISPR-Cas12a for sensitive and visual antibiotic resistance diagnosing" Chen H, Li B, Shi S [..] Shi W, Ren L. Anal Chim Acta. 2023-02-25. https://doi.org/10.1016/j.aca.2023.341014 [著者所属] Xiamen U, Institute of Computing Technology (Beijing), School of Computer Science and Technology (Beijing), Hunan U；グラフィカルアブストラクト

　CRISPR-Cas12aシステムが標的耐性遺伝子を認識すると、そのトランス切断活性が活性化され、続いてAu–Fe3O4ナノザイムが放出され、3,3,5,5--テトラメチルベンジジン（TMB）が透明から青色に変色しながら酸化される。このシグナルを、スマホで撮影・解析する。

　本手法によって、簡単な操作でカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子を高感度（0.1 CFU/μL以下）かつ迅速（1時間以下）で検出可能なことを実証した。

　本手法は、現場での抗生物質耐性遺伝子（ARG）や抗生物質耐性菌（ARB）の正確かつ高感度な検出を可能にし、水質の監視・制御に適用可能である。

2023-03-03 =============

血中循環腫瘍DNA (ctDNA) の検出：HCRとCas12aの組み合わせによる二重増幅によりLoD 5.43 fMを達成

[出典] "Proximity hybridization-regulated CRISPR/Cas12a-based dual signal amplification strategy for sensitive detection of circulating tumor DNA" Li M, Luo N, Liao X, Zou L. Talanta. 2023-02-24. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2023.124395 [著者所属] Guangdong Pharmaceutical U；グラフィカルアブストラクト

　本手法では、ctDNAが、2つのヘアピンプローブ（H1、H2）の連続的なハイブリダイゼーションによってHCRを起動し、多数の分割セグメントからなる長いニック付き二本鎖DNAナノワイヤーが生成し、これが順次連結されてCRISPR/Cas12aのトランス開裂活性を活性化させる。この活性化によって、二重標識された一本鎖DNAレポーターが切断され、強い蛍光シグナルが発生する。

　本手法は、ヒト血清中の標的ctDNAの定量にも適用可能である。

2023-03-02 =============

miRNAの検出：Cas12aを利用して、これまでの指数関数的増幅反応 (EXPAR) に対する非特異的増幅の影響を排除する

[出典] "CRISPR-Cas12a-assisted elimination of the non-specific signal from non-specific amplification in the Exponential Amplification Reaction" Niu C, Liu J, Xing X, Zhang C. Anal Chim Acta 2023-04-22. https://doi.org/10.1016/j.aca.2023.340998 [著者所属] Tsinghua U, U Waterloo；グラフィカルアブストラクト

　核酸増幅において非特異的増幅は大きな問題であり，特にEXPARにおいて出現する偽陽性が問題である。非特異的増幅の影響を抑えるために、テンプレートの3′末端の化学的阻害や、テンプレート間の相互作用を配列に依存せずに弱めるなどの工夫がなされて来たが、従来の多くのEXPAR反応では依然として共通の問題であった。

　著者らは、CRISPR-Cas12aシステムをtwo-template EXPARに組み込むことによって非特異的増幅をフィルターするEXPAR-Cas12a戦略を具体化し、EXPCasとして発表した。

　EXPCasにより、S/B比が1.3から15.4に向上し、miRNA-21をターゲットとした場合、非特異的な増幅を許すことなく、40分以内の検出と検出限界 103 fMを実現した。

2023-03-01 =============

サル痘ウイルスの検出：LAMP法とCRISPR/Cas12b診断プラットフォームの組み合わせ

[注] エムポックス (mpox: MPX) サルから発見されたことから当初「サル痘」と呼ばれた

[出典] "Ultrasensitive and Specific Identification of Monkeypox Virus Congo Basin and West African Strains Using a CRISPR/Cas12b-Based Platform" Chen X, Yuan W, Yang X, Shi Y, Zeng X, Huang J, Wang Y, Li S. Microbiol Spectr 2023-02-22. https://doi.org/10.1128/spectrum.04035-22 [著者所属] Guizhou U Traditional Chinese Medicine, Guizhou Provincial Center for Clinical Laboratory, Capital Institute of Pediatrics

　MPXウイルス（MPXV）は、コンゴ盆地型と西アフリカ型の２系統に分類されている。表題の結果をリアルタイム蛍光測定と、金ナノ粒子をベースとするラテラルフローバイオセンサー（AuNP-LFB）にて、読み出した。

　ゲノムDNA抽出（15分）、LAMP前置増幅（66℃で35分）、CRISPR/Cas12bによる検出（45℃で5分）、AuNP-LFB読み出し（～2分）を含む最適検出プロセスは、高価な機器を使用せずに60分以内に完了する。また、検出限界は10コピー/回であり、他の病原体との交差反応もない。

　このCRISPR-MPXV法は、特に資源不足の地域において、MPXV コンゴ盆地株と西アフリカ株の同定・鑑別のための POC Tに大きな可能性を示すものである。

2023-02-28 =============

低分子とタンパク質の検出：CRISPR-Cas12aベースの蛍光/比色バイオセンサー

[注] UCNP（Upconversion Nanoparticles）

[出典] "The development of a fluorescence/colorimetric biosensor based on the cleavage activity of CRISPR-Cas12a for the detection of non-nucleic acid targets" Wang Y [..] Gao Z. J Hazard Mater. 2023-02-20. https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2023.131044

　著者らは、UCNPs-Cas12aとハイドロゲル-MOF-Cas12a [グラフィカルアブストラクト参照] の２種類のセンサーを開発した。

　この2つのセンサーは、アプタマーを利用して標的分子を核酸 (DNA)シグナルに変換し、触媒的ヘアピン集合（CHA）によりDNAシグナルを増幅し、CRISPR-Cas12aと各種ナノ材料を組み合わせて、複数の種類のシグナル出力を得ることを可能にする。

　UCNPs-Cas12a/ハイドロゲル-MOF-Cas12aはエストラジオール（E2）と前立腺特異抗原（PSA）の検出において優れた感度と安定性を示し、牛乳や血清サンプル中のこれらの標的の検出に成功した。ハイドロゲル-MOF-Cas12aシステムには、シグナルの出力を直接観察可能とする利点がある。

　今回、複数の標的をターゲット可能で、多様なシグナルの出力を実現するCas12aバイオセンサーは、食の安全、環境モニタリング、臨床診断などの広範な分野への展開を可能とする。

2023-02-27 ============= (2件)

1. メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA) の可視化迅速同定：CRISPR-Cas12aとRPAおよびMNPの組み合わせ

[注] RPA (リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法)；MNP (磁気ナノ粒子)

[出典] "CRISPR/Cas12a coupling with RPA and MNPs for rapid and visualized identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus " Wu X [..] Zhang GJ. Sens Actuators B Chem. 2023-02-20. https://doi.org/10.1016/j.snb.2023.133546 [著者所属] Hubei U Chinese Medicine, Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Tongji Medical College

　著者らは、MRSAのmecA 遺伝子検出を目的として、RPAとMNPsを組み合わせたCRISPR/Cas12aバイオセンサーに基づく迅速、高特異性、超高感度な比色測定法を開発し、1 - 1 x 10^6> aMの線形範囲と検出限界 0.2 aMを達成した。さらに、本法はMRSA感染患者からの検出にも成功し、その結果は培養法およびqPCR法と良く一致した。

　本法は、肉眼で観察可能な色の変化により、2時間以内に迅速かつ正確にMRSAを同定できることから、今後の薬剤耐性菌同定のためのPOCT（Point of Care Testing）の実用化に向けて期待できる。

食中毒病原体検出：CRISPR/Cas12aを介した鎖置換/ハイブリダイゼーション連鎖反応を利用し比色で検出するCSDHCR

[注] CSDHCR: CRISPR/Cas12a SDHCR (CRISPR/Cas12a mediated Strand Displacement/Hybridization Chain Reaction)

[出典] "An Ultrasensitive Colorimetric Foodborne Pathogenic Detection Method Using a CRISPR/Cas12a Mediated Strand Displacement/Hybridization Chain Reaction" Jiang Y [..] Lou Y, Zheng L. J Agric Food Chem 2023-02-22. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.2c08888 [著者所属] Wenzhou Medical U.

　本法では、アビジン磁気ビーズ上に結合したビオチン化DNAトーホールドをSDHCRを誘発する開始鎖として機能させ、SDHCRの増幅により、TMB-H2O2反応を触媒する長いヘミン/G-四重鎖ベースのDNA酵素生成物の形成を可能にした。標的DNAの存在下では、CRISPR/Cas12aのトランス切断活性が活性化して開始鎖DNAを切断し、SDHCRが成立せず色の変化が見られない。

　最適な条件下で、CSDHCRは10 fMから1 nMの範囲でY = 0.0531*X - 0.0091 (R2 = 0.9903) が成立し、検出限界は4.54 fMに達した。

　また，CSDHCRは、食中毒病原体の一つであるVibrio vulnificus を標的とする実証実験でも十分な特異性と感度 (LoD 1.0 CFU/mL) を示した。

2023-02-26 =============

時分割走査型光ピンセットによる二光子蛍光イメージングを利用して、汎用的CRISPR/Cas12aバイオセンサーを開発
[出典] "Using time-shared scanning optical tweezers assisted two-photon fluorescence imaging to establish a versatile CRISPR/Cas12a-mediated biosensor" Liu D, Sun XM, Zhu L, Li CY. Biosens Bioelectron. 2023-02-22. https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115158 [著者所属] Wuhan U Science and Technology, Hubei U Medicine, Wuhan Polytechnic U

　CRISPR/Cas12aシステムをベースに主として核酸を標的とする高感度なバイオセンサーが開発されたが、さらなる高感度や、複雑な実サンプルへの応用、検出対象分子の拡大などが求められている中で、中国の研究チームが、CRISPR/Cas12aバイオセンサーの汎用化を試みた。

まず、マイクロスフェア (microsphere) による持続的な信号増幅と、自家製の時分割走査型光ピンセットを利用した蛍光イメージングにより、安定した励起を保証し、マルチフレックスアッセイを実現した。
また、近赤外光励起二光子蛍光の低バックグラウンド性を生かし、複雑な媒体中での優れた抗干渉性を発揮させた。
さらに、アプタマーやDNAzymeなどの機能的なDNAを介して、タンパク質や金属イオンなどの非核酸分析物検出を実現した。
本分析手法は、疾病診断や環境分析などの様々な応用において汎用的で信頼性の高いツールボックスとして機能すること期待される。

2023-02-25 (3件) ============= [12:04更新; 1件追加]
1. [プレスリリース] シャーロック、USTPOからCas12のコラテラル活性を利用する核酸検出法診の特許を獲得

[出典] Press Release "Sherlock at Apex of CRISPR-based Diagnostics after USPTO Grants Earliest Priority Patent" Sherlock Bioscience. 2023-02-21. https://sherlock.bio/sherlock-at-apex-of-crispr-based-diagnostics-after-uspto-grants-earliest-priority-patent/

　シャーロックは、Broad InstituteからのCas12とCas13に関する追加の知的財産 (IP)と上海を本拠とするTolo Biotechの特許の米国内での独占的ライセンスを取得したことで、2社共同でCas12 CRISPRDx IPの世界的な独占を実現し、CRISPRDxの分野の頂点 (at Apex of CRISPR-based Disgnostics) に立った、と発表した。

2. [レビュー] を用いたCRISPR-Casセンサーの拡充 - 核酸からバイオマーカーと低分子へと標的が多様化. crisp_bio 2023-02-25 https://crisp-bio.blog.jp/archives/31652722.html

3. エクソソーム・マイクロRNAの検出：電気化学発光バイオセンサーとCRISPR/Cas12aシグナル増幅の組み合わせ

[注] エクソソーム・マイクロRNA（exosomal microRNAs: exomiRNAs）

[出典] "Mesoporous Nanozyme-Enhanced DNA Tetrahedron Electrochemiluminescent Biosensor with Three-Dimensional Walking Nanomotor-Mediated CRISPR/Cas12a for Ultrasensitive Detection of Exosomal microRNA" Shen B [..] Ding S. Anal Chem 2023-02-20. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c05217 [著者所属] Chongqing Medical U, Chongqing General Hospital, The Fifth People’s Hospital of Chongqing, Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine.

　中国の研究チームはまず、3次元歩行ナノモーターを介したCRISPR/Cas12aセンサーにより、標的のexomiR-155を生体信号へと効果的に増幅・変換することで、感度と特異性を向上させ、それに、優れた触媒性能を持つTCPP-Fe@HMUiO@Auナノザイムにより、エレクトロケミルミネッセンス (ECL) 信号の増幅を加えることで、exomiRNAsの超高感度ECLバイオセンサを実現した。検出限界と直線範囲はそれぞれ、273.20 aMと1.0 fM ~ 1.0 nMを達成し、exomiR-155に基づく乳がん患者の識別が可能になり、その診断結果はqRT-PCRによる診断結果と一致した。

2023-02-24 =============

食肉偽装の検出：RPAとCRISPR/Cas12aに基づくマルチスループットPOCT技術とその応用

[注] POCT (Point Of Care Testing)

[出典] "Multi-throughput POCT Technology Based on RPA and CRISPR/Cas12a and Its Application in Detection of Adulterated Meat" Ding W [..] Sun W. ACS Food Technol. 2023-02-20. https://doi.org/10.1021/acsfoodscitech.2c00390 [著者所属] Soochow U, Suzhou Institute for Food Control, Suzhou Center for Disease Control and Prevention

　高価格帯の食肉（牛肉、羊肉）に低価格帯の食肉（豚肉、鶏肉、鴨肉）を混ぜることは、消費者を欺くだけでなく、食の安全や宗教上の信条の問題でもある。中国の研究チームは、ユニバーサルプライマーを介したリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）とCRISPR/Cas12aコラテラル活性を介したシグナル増幅をマイクロ流体装置へと統合することで、その場（on-site）での遺伝子検出技術を確立し、偽装食肉の検出に応用した。

　この技術によって、37℃で1時間以内に、蛍光信号によって製品中の牛肉、マトン、豚肉、鶏肉、アヒルの多重識別が可能になった。検出感度はDNA濃度10 pg/μLに達し、高価格の食肉原料の中に低価格の食肉原料が1%混入していても検出可能であった。

2023-02-23 =============

水サンプル中のカナマイシン検出：アプタマー + 触媒ヘアピン集合 (CHA) + Cas12a + プローブ + 市販の血糖値測定器の組み合わせからなるポータブルバイオセンサー

[出典] "Portable biosensor for on-site detection of kanamycin in water samples based on CRISPR-Cas12a and an off-the-shelf glucometer" Chen J, Shi G, Yan C. Sci Total Environ 2023-02-16. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2023.162279 [著者所属] Institute of Eco-environmental and Soil Sciences；グラフィカルアブストラクト

　アプタマーとカナマイシンの相互作用により、トリガーとなるC鎖が解放され、ヘアピン集合が開始して多数の二本鎖DNAが生成され、これを認識したCRISPR-Cas12aが磁気ビーズとインベルターゼで修飾された一本鎖DNAを切断する。磁気分離後、インベルターゼがスクロースをグルコースに変換することから、カナマイシンの血糖値測定器での定量が可能になる。

　この血糖値測定器のバイオセンサーの直線範囲は1 pMから100 nMで、検出限界は1 pMであり、カナマイシンに対して高い選択性を示した。さらに、このバイオセンサーは堅牢で、複雑なサンプルでも優れた精度と信頼性で動作する。回収率は水サンプルで89-107.2 %，牛乳サンプルで86-106.5 %の範囲であった。また、変動係数（Relative standard deviation）は5 %未満であった。

　簡単な操作，低コスト，一般の人々にも使いやすいという利点を持つこの携帯用ポケットサイズのセンサーは，資源に乏しい環境での残留抗生物質のオンサイト検出に利用可能である。

2023-02-22 =============

ヒト・ボカウイルス1（HBoV1）の検出：迅速・高信頼性のRPA-Cas12a-蛍光アッセイ法

[出典] "Development of RPA-Cas12a-fluorescence assay for rapid and reliable detection of human bocavirus 1" Qian W [..] Li Y, Chen S. Animal Model Exp Med. 2023-02-15. https://doi.org/10.1002/ame2.12298 [著者所属] Shaanxi U Science and Technology, Huazhong U Science and Technology Union Shenzhen Hospital, Ningbo Municipal Center for Disease Control and Prevention, Medical College of Shenzhen U.

　本アッセイ法は、高度な装置を必要とせず、37℃で40分以内にHBoV1プラスミドDNAを0.5コピー/μLという高感度で標的遺伝子を検出可能であり、また、非標的病原体に対する交差反応性もなく、優れた特異性を示す。さらに、本法は28件の臨床サンプルでによる検証において、陽性的中率90.9%、陰性的中率100%と高い精度を示した。

2023-02-21 =============

HIVの検出：CRISPRを利用し生体を模倣したカスケード反応系を介してグルコースメーターでのHIV検出を実現

[出典] "Bioinspired CRISPR-Mediated Cascade Reaction Biosensor for Molecular Detection of HIV Using a Glucose Meter" Li Z, Uno N, Ding X, Avery L, Banach D, Li C. ACS Nano 2023-02-10. https://doi.org/10.1021/acsnano.2c12754 [著者所属] U Connecticut Health Center.

　CRISPR/Cas技術は、近年、等温増幅法と組み合わせることで、高感度かつ特異的な核酸ベースの分子検出のための強力なツールとして登場した。中国の研究チームは今回、細胞内のマルチコンパートメント構造にヒントを得て、CRISPRを介したマルチ酵素反応の互換性を向上させるために、ナノ多孔質膜で分離（コンパートメント化）された人工カスケード反応系を提案した。さらに、このマルチ酵素カスケード反応系をマイクロ流体プラットフォームとグルコース・バイオセンシング技術と統合し、生体模倣CRISPR-mediated cascade reaction（CRISPR-MCR）バイオセンサーを開発し、糖尿病の在宅検査に類似した簡易グルコースメーターでHIV分子検出を可能にした。

　生体模倣CRISPR-MCRバイオセンサーをHIV DNAおよびHIV RNAの検出に適用し、それぞれ43コピーおよび200コピー/テストの検出感度を達成した。さらに、HIVの臨床血漿サンプルを検査して生体模倣バイオセンサーを検証することに成功し、家庭や資源が限られた環境でのHIVウイルスやその他の病原体のポイントオブケア検査への大きな応用の可能性を示した。

2023-02-20 =============

腫瘍由来ctDNAの検出：CRISPR/Cas12aシステムによる非小細胞肺がん (NSCLC)由来の血中循環腫瘍変異DNAの普遍的かつ高精度な検出

[注] ctDNA (circulating tumor DNA/血中循環腫瘍DNA）

[出典] "Universal and highly accurate detection of circulating tumor DNA mutation in non-small cell lung cancer based on CRISPR/Cas12a system" Wang X [..] Sun F, Hu X. Sens Actuators B Chem. 2023-02-10. https://doi.org/10.1016/j.snb.2023.133493 [著者所属] Tongji U, Shanghai Center for Clinical Laboratory, Shanghai Jiao Tong USchool of Medicine

　NSCLCに特異的なctDNAは、リアルタイムかつ低侵襲な診断に有望なバイオマーカであり、CRISPR-Casシステムを利用したアッセイ系で検出可能である。しかし、それにはNSCLC特異的な変異部位の近くにPAM配列が位置する必要があること、変異型と野生型の配列、特に一塩基変異、が極めて似ていることから、オフターゲット切断がもたらす偽陽性が、その適用の障害になっている、

　中国の研究チームは今回、RPAとCRISPR/Cas12aを組み合わせ、crRNAに一塩基または二塩基のミスマッチを導入することで、オフターゲット編集を効果的に低減した。

　その結果、ctDNAの変異の検出限界100 aMを達成し、等温制御50分間で0.02%のアレル頻度の変異の同定まで実現した。また、NSCLCの複数の臨床サンプルに適用し、その結果はリアルタイムPCR分析によって検証された。

2023-02-19 =============

RNAの検出：DNA回路を介したPAM非依存CRISPR/Cas12aとPolyAローリングサークル増幅による汎用的かつ特異的なセンサー'DCPRBiosensor'

[出典] "A universal and specific RNA biosensor via DNA circuit-mediated PAM-independent CRISPR/Cas12a and PolyA-rolling circle amplification" Wang S, Li H [..] Feng D, Xiao X, Zhang W. Biosens Bioelectron. 2023-02-08. https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115139 [著者所属] Tongji Medical College, Nanchang U

　DCPRBiosensorの検出限界は100 aMに達し、100 aMと10 pMの間に直線的な関係がある。4種類のpiRNAを検出し、DCPRBiosensorの汎用性と安定性を検証した。また、DCPRBiosensorが一塩基ミスマッチに対して良好な識別能力を持つことを確認した。

2023-02-18 =============

miRNAの検出：CRISPR-Cas12aをナノ粒子表面に固定した３次元ナノマシンにより高感度かつ安定した検出を実現

[出典] "A novel nanoparticle surface-constrained CRISPR-Cas12a 3D DNA walker-like nanomachines for sensitive and stable miRNAs detection" Wang X, Mu X, Li J, Liu G, Zhao S, Tian J. Ana Chim Acta. 2023-02-08. https://doi.org/10.1016/j.aca.2023.340950

　Cas12aの一本鎖DNAのトランス切断活性（コラテラル活性）をベースとするバイオセンサーの課題の一つが、溶液中でのトランス切断反応効率は相対的に低いことである。このマイナス要因を克服するために著者らは球状核酸（spherical nucleic acids: SNA）にCas12a活性化因子を搭載し、金ナノ粒子（AuNP）表面のCRISPR-Cas12a活性化因子系がウォーカーとして働き、AuNP表面で、「認識 - ウオーク - 切断反応」を連続的に行い、SNAに対するCas12aのトランス開裂活性を高めるアプローチを考案・実現した [グラフィカルアブストラクト参照 ]。

　この新規な3次元DNAナノマシンを開発し、miRNA-21の高い感度と精度を達成し、検出限界8.0pMを達成した。

2023-02-17 =============

創薬標的候補のヌクレアーゼの活性検出：CRISPR/Cas12aベースであるが、増幅を伴わない蛍光アッセイによる超高感度な検出

[出典] "An amplification-free CRISPR/Cas12a-based fluorescence assay for ultrasensitive detection of nuclease activity" Wang X, Chen Y, Ma L, Han Z, Liu Y, Qiao J. Talanta 2023-02-08. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2023.124329；グラフィカルアブストラクト

　多くの細胞内プロセスで重要な役割を担っているヌクレアーゼは創薬の標的候補であり、その活性を迅速かつ簡便に検出する方法が求められている。本論文では、RNase H および DNase I の活性を超高感度に検出するために、核酸増幅工程を一切必要としない Cas12a ベースの蛍光アッセイを開発した。

　本アッセイは、crRNA/ssDNA 二重鎖が、 Cas12a 酵素の存在下で蛍光プローブの切断を誘発し、一方で、RNase H や DNase I を添加すると、crRNA/ssDNA 二重鎖が選択的に消化され、蛍光強度が変化することを利用している。最適化された条件下で検出限界（LOD）はRNase Hで0.0082 U/mL、DNase Iで0.13 U/mLを達成した。

　本法は、ヒト血清や細胞ライセート中のRNase Hの分析、および酵素阻害剤のスクリーニングに適用可能であることが確認された。さらに、本法は生細胞中の RNase H 活性を可視化することも可能である。

2023-02-16 =============

HBV検出：RAA + CRISPR/Cas13a ＋コロイド金試験ストリップによる低レベルウイルス血症患者に対する迅速かつポータブルなHBV DNA検出法

[注] HBV（hepatitis B virus/B型肝炎ウイルス）

[出典] "CRISPR/Cas13a-assisted Rapid and Portable HBV DNA Detection for Low-Level Viremia Patients" Tian Y, Fan Z, Xu L [..] Duan Z, Zhang X, Ren F. Emerg Microbes Infect. 2023-02-03. https://doi.org/10.1080/22221751.2023.2177088[著者所属] Capital Medical University, Beijing Institute of Hepatology, Beijing Institute of Microbiology and Epidemiology

　WHOは2030年までのHBV絶滅を宣言している。しかし、HBV感染症の診断効率は低く診断可能な地域が限られ、また、抗ウイルス薬の普及に伴い、低レベルウイルス血症（low-level viremia: LLV）患者が増えている。本研究は、中小規模の検査室や野外調査において、HBV感染検出を効率的に行うことを目的とした。

　標題技術によるHBV DNAの検出感度と特異度はそれぞれ10 cipies/Lと100%であった。180人のHBV感染者（異なるウイルス量の患者、LLV患者、抗ウイルス療法中の患者の動的血漿試料を含む）を対象とする検証において、陽性一致率87%と陰性一致率100%であった。抗ウイルス療法中の患者における血漿中動態検出の感度、特異度、陽性一致率、陰性一致率は、それぞれ100％、92.15％、93.75％、 100％となった．

　本手法は、PCR法に代わる視覚的で迅速な診断法である。

2023-02-15 =============

HPV16とHPV18の同時多重検出：CRISPR/Cas12aとRPAをスタンドアロンのマイクロ流体プラットフォーム上で組み合わせることで、高速かつ並列な核酸検出を実現

[出典] "Coupling CRISPR/Cas12a and Recombinase Polymerase Amplification on a Stand-Alone Microfluidics Platform for Fast and Parallel Nucleic Acid Detection" Zhou H [..] Li Y, Yang Y, Huang X. Anal Chem 3023-02-03. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c04713 [著者所属] Tongi Medical College, Wuhan Institute of Physics and Mathematics；グラフィカルアブストラクト

　HPV16とHPV18を高い特異性と検出感度（未増幅プラスミドおよび増幅プラスミドに対してそれぞれ0.5 nMおよび1 × 10<-18> M）で30分間で同時に検出することが可能である。さらに、HPV DNAの可視化検出を可能にするため、最適化されたラテラルフローディップスティック（LFD）をポータブルシステムに組み込んだ。LFDは増幅プラスミドに対して1×10<-18>Mの検出感度を有し、臨床検体中のHPV亜型の検出に成功した。最後に、HPV亜型のサンプルイン・アンサーアウト検出を可能にする自動マイクロ流体システムを確立した。

2023-02-14 =============

HPV16とHPV18の同時多重検出：ハイドロゲル微粒子にCas12a/gRNAを内包させることで、CRISPRDxによる多重標的の検出を実現するCLAMP

[出典] "CRISPR-Enhanced Hydrogel Microparticles for Multiplexed Detection of Nucleic Acids" Roh YH [..] Lee JH, Lee H. Adv Sci (Weinh). 2023-02-01. https://doi.org/10.1002/advs.202206872 [著者所属] Institute for Basic Science, Yonsei U, Massachusetts General Hospital Research Institute.

[注] CLAMP（Cas-Loaded Annotated Micro-Particles）；ハイドロゲル微粒子（Hydrogel Microparticles, HMP）

　CLAMPは、Casタンパク質を空間的にコードされたHMPに固定化し、各HMPをNA検出のための個別の容器とすることから始まる [Scheme 1引用右図 i 参照]。空間コードで標識した各HMPタイプは、ユニークなNAターゲットに特異的であり、意図した核酸ターゲットを認識すると、Cas12a/gRNA複合体はF-Qプローブを切断し、HMP内の蛍光シグナルを発する。次に、シグナルの検出を容易にするために、マイクロ流体デバイスを設計した。この流体装置により、個々の HMP の位置を特定することが容易になり、さらに、HMP を非混和性のオイルで囲むことができるため、シグナルとバックグラウンドのコントラストを向上させることができるようになった。
　さらに、HMPの種類を特定し、その蛍光強度を定量化するために、機械学習を利用し、自動認識を実現した [Figure 3引用左図参照]]。これらの機能を組み合わせて，i）高感度（アトモル検出限界），ii）追加の標識や洗浄工程が不要なシンプルなプロセス，iii）シングルポットでの多重標的核酸検出，という特徴を実現した．

　CLAMPの臨床応用の可能性を探るため、子宮頸部ブラッシング検体中の高リスクのヒトパピローマウイルス（HPV16とHPV18 ）およびコントロールとしてのハウスキーピング遺伝子（GAPDH）の多重検出などを実現した。

　CLAMPアッセイは、高速かつ高感度（前置増幅によるアトモル検出限界）であり、シングルポットアッセイでのマルチプレックスが可能である。

[CRISPRDx多重化関連crisp_bio記事 - 互いに直交するCasを利用する]

2020-02-15 CRISPRによる核酸検出・診断 (DETECTRとSHERLOCK). https://crisp-bio.blog.jp/archives/7449195.html
[SHERLOCKv2 論文] Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. "Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6" Science. 2018 Apr 27;360(6387):439-444. Published online 2018 Feb 15. https://doi.org/10.1126/science.aaq0179

2023-02-12 =============

核酸検出：PAMの制約を受けないワンステップRPA-CRISPR検出（ORCD）システムによる核酸の高速・可視化検出

[出典] "Fast and visual detection of nucleic acids using a one-step RPA-CRISPR detection (ORCD) system unrestricted by the PAM" Lin K, Guo J, Guo X [..] Wu J, Zhang R, Li B. Anal Chim Acta 2023-02-03. https://doi.org/10.1016/j.aca.2023.340938 [著者所属] Xiamen U (厦門大学)

　Cas12aバイオセンサーが病原体の検出に広く利用されているが、PAM配列からの制限が課題である。また、多くのCas12aバイオセンサーが前の増幅とCas12aの2ステップで構成されている。厦門大学の研究チームが今回、PAM配列の制約を受けず、高感度・高特異性で、ワンチューブ、高速、かつ視覚的に検出可能なRPA-CRISPR検出（ORCD）システムを開発した。

研究チームはまず、crRNA/Cas12aが非PAM標的を認識し、PAM配列を持つdsDNAに対する効果に比べ、シス切断活性は弱いが、ssDNAレポーターのトランス切断活性は、非PAM標的配列に対してもPAMを伴う配列に対するのと同程度の活性を示すことを確認した [FIg. 1引用右図 d 参照]。
ORCDでは、核酸のRPA増幅とCas12aによるssDNA レポーターのトランス切断が同時進行し [グラフィカルアブストラクト引用左図の右上参照]、前増幅と産物転送を別々に行うことなく、0.2コピー/μLのDNAと0.4コピー/μLのRNAの検出を実現した。
この検出技術を核酸抽出不要の方法と組み合わせることで、ORCDシステムは30分以内に試料の抽出、増幅、検出を可能とし、百日咳菌の臨床試料82個を用いた試験では、PCRと比較して感度97.30%、特異度100%を達成した。
また、SARS-CoV-2の13検体をRT-ORCDで検査したところ、RT-PCRと同様の結果が得られた。

2023-02-11 =============

CRISPR/enAsCas12aによるメラノコルチン1型受容体（MC1R）遺伝子のSNPsの検出

[出典] "Detecting Melanocortin 1 Receptor Gene’s SNPs by CRISPR/enAsCas12a" Yang W, Tao D, Xu B, Zheng Y, Zhao S. Genes. 2023-02-02. https://doi.org/10.3390/genes14020394 [著者所属] Huazhong Agricultural U, Guangdong Laboratory of Lingnan Modern Agriculture, Henan Agricultural U

　CRISPRDxの多くは、主にバクテリアやウイルスの核酸検出に用いられており、一塩基多型（SNP）検出への応用は限定的であった。中国の研究チームは今回、CRISPR/enAsCas12aを用いて、PAM配列に限定されないMC1RのSNPをin vitroで検証した結果、MC1RのSNPが、PAM配列に限定されないことが明らかになった。具体的には、反応条件を最適化し、enAsCas12aが2価のマグネシウムイオン（Mg2+）を好み、Mg2+存在下で1塩基差の遺伝子を効果的に識別できることを証明し、3種類のSNP部位（T305C、T363C、G727A）を有するMC1R遺伝子の定量的検出を実証した。

　enAsCas12aはin vitro ではPAM配列に制限されないため、一般的なSNP検出ツールボックスへと展開可能である。

[関連crisp_bio記事]

2021-03-24 新型コロナウイルス変異株検査: enAsCas12aとDNA-RNAハイブリッド・ガイドを利用. https://crisp-bio.blog.jp/archives/25924554.html

2019-02-12 CRISPR-Cas12aの拡張、東西で続く - enAsCas12a. https://crisp-bio.blog.jp/archives/15642277.html

2023-02-10 =============

ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）の検出：CRISPR-Cas12a とDNA ハイブリダイゼーション反応に基づく超高感度バイオセンサーによるウラシル DNA グリコシラーゼ検出と細胞内イメージングの実現

[出典] "Ultra-sensitive biosensor based on CRISPR-Cas12a and Endo IV coupled DNA hybridization reaction for uracil DNA glycosylase detection and intracellular imaging" Dong K, Shu W [..] Zhang W, Wang H. Biosens Bioelectron 2023-02-03. https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115118 [著者所属] Tongji Medical College, Clinical Research Center of Cancer Immunotherapy of Hubei.

　UDGは、様々な疾患に関連する必須バイオマーカーとして、その検出が、疾患診断、治療選択、予後判定に不可欠である。近年、CRISPR-Cas12aのトランス切断活性をベースとする一本鎖DNAプローブのシグナル増幅効果により、高感度バイオセンサーを構築することが可能になってきた。しかし、その優れたトランス切断活性は、標的シグナルを増幅する一方で、リークシグナル（leakage signal）も増幅して制御不能に陥るという「諸刃の剣」になっている。

　中国の研究チームは今回、高感度でありつつ、構造的に単純で、バックグラウンドが極めて低いCRISPR-Cas12aベースのバイオセンサーの構築を目指した。CRISPR-Cas12aにDNAハイブリダイゼーション反応を組み合わせて、簡便・迅速・低バックグラウンド・高感度なUDGの活性検出法を開発した。

　本法はPAMの制限を受けず、検出限界は2.5×10-6 U/mLに至り、UDGの検出法として最も高感度な方法の一つである。また、本システムを用いて、腫瘍細胞におけるUDG活性の解析（LoD: 1 cell/uL）、UDG阻害剤のスクリーニング能力の評価も行った。

　さらに、このバイオセンサーを細胞に導入することにより、細胞内UDG活性のイメージングが可能であることを検証した。
　こうした結果を得て、著者らは、この新規センサーは臨床応用の見通しが良く、CRISPR-Cas12aの応用空間を効果的に広げる、とした。

2023-02-09 =============

２種類のヒトパピローマウイルス（HPV）の同時検出：マルチプレックスRPAとCRISPR-Cas12aの系をマイクロ流体デュアルドロップレット装置に組み込むことで、HPV16とHPV18の同時検出を実現

[出典] "Integrating CRISPR-Cas12a into a Microfluidic Dual-Droplet Device Enables Simultaneous Detection of HPV16 and HPV18" Zhao Y [..] Xu G, Li Y, Yang Y, Liu M. Anal Chem. 2023-02-01. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c05320 [著者所属] Wuhan U, Tongi Medical College, Wuhan Institute of Physics and Mathematics；グラフィカルアブストラクト

　現在のHPV検出法では、複数の標的検出には高度な機器と手間のかかる手順が必要である。中国の研究チームは、CRISPR-Cas12aシステムとマルチプレックスRPAを組み合わせることにより、HPV16とHPV18を同時に検出するシンプルなマイクロ流体デュアルドロップレット装置（M-D3）を開発した。

最小限のサンプル消費で効率的に液滴を生成するために、圧力/真空を組み合わせた新しいアプローチを提案した。
M-D3では、Cas12a-crRNAと緑色または赤色の蛍光レポーターを別々にカプセル化した2つの液滴群を並行して生成し、その後、液滴の固有の蛍光に基づきHPVサブタイプを画像を介して自動識別する。
M-D3によって、HPV16およびHPV18のDNAを高感度（未増幅プラスミドで約0.02nM）かつ特異的に検出できることを確認した。
HPV16とHPV18のDNAを同時に30分以内にオンチップで検出することができ、検出限界は10<-18> M（約1コピー/反応）に達した。
さらに、HPV感染リスクのある臨床患者20検体で検証し、感度 92.3％と特異度 100％を得た。

　今回開発したプラットフォームは、HPVに限らず、マルチプレックス核酸検査の応用において大きな可能性を持っている。

2023-02-08 =============

遺伝子組み換え（GM）作物検出：PCR + Cas12a + 蛍光検出

[出典] "An Accurate, Rapid and Cost-Effective Method for T-nos Detection Based on CRISPR/Cas12a" Wang Y, Peng C [..] Sun M, Xu J. Foods. 2023-01-01. https://doi.org/10.3390/foods12030615 [著者所属] Zhejiang Normal U, State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-Products, Ningbo U.

　GM作物作製に利用されているT-nos（ノパリン合成酵素ターミネーター）を標的とするCas12aバイオセンサーを開発した。11 種類のダイズ試料を評価し、50 分以内の反応で 60 コピーという低レベルの標的遺伝子を正確かつ特異的に検出することができた。

2023-02-07 =============

ブレオマイシン (BLM)の定量：Cas12aにグアニン四重鎖（G4）とチオフラビンT複合体（ThT）の蛍光を組み合わせた無標識蛍光バイオセンサー

[出典] "Label-free and highly sensitive fluorescent detection of bleomycin based on CRISPR-Cas12a and G-quadruplex-thioflavin T" Liao X, Leo N, Li M, Fu H, Zou L. Sens Actuators B Chem. 2023-02-01. https://doi.org/10.1016/j.snb.2023.133459 [著者所属] Guangdong Pharmaceutical U, The First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University；

　[グラフィカルアブストラクト参照] Cas12aのコラテラル活性を駆動する因子としてBLMの切断部位を含む一本鎖 DNA（ssDNA）プローブを設計した。この活性化因子は、BLM 非存在下ではCas12aに結合してコラテラル活性を起動し、G4-ThT複合体形成を阻害する。この活性化因子は一方で、BLM存在下では、鉄（Ⅱ）を補因子とするBLMの酸化作用により、切断部位で不可逆的に切断され、その結果、Cas12aのコラテラル活性は発揮されず、G4-ThT複合体が形成され、蛍光シグナルが大幅に増大する]。

　この蛍光バイオセンサーは、45 pMという高感度を示し、ヒト血清中のBLMの検出を可能にした。

2023-02-06 =============

一塩基変異の検出：Cas12aによる高速・高精度検出（二つの手法）

[出典] "Two CRISPR/Cas12a-based methods for fast and accurate detection of single-base mutations" Ling C, Chang Y [..] Liu B, Huang S. Anal Chim Acta. 2023-01-29. https://doi.org/10.1016/j.aca.2023.340881 [著者所属] The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical U

　一塩基の変異を正確かつ迅速に低コストで検出する技術への必要性が高まっている。中国の研究チームが、Cas12aによるシグナル増幅の前増幅にPCRを組み合わせる手法（1）とRPAを組み合わせる手法（2）を提案した。

（1）プライマーの3’末端にミスマッチ塩基を導入し、PCRの条件を調整することで、Cas12aが反応する前に、野生型配列の増幅を完全に阻害することで、約６コピー/μLも感度を達成した。

（2）RPAにより一塩基変異部位に隣接して余分なミスマッチ塩基を導入する（IMAS*-RPA）ことにより、野生型配列からのRPA産物がCRISPR/Cas12aの切断活性を誘発することができない状態にする。この手法は迅速かつ簡易であり１時間以内に終了する。

[*] IMAS: Introducing an extra Mismatched base Adjacent to the Single-base mutant site

2023-02-05 (2件) ========

1. 新型コロナウイルススパイクタンパク質S1サブユニットの検出：最適化したアプタマーを組み合わせることで高感度なCas12aバイオセンサーを実現

[出典] "Customization of aptamer to develop CRISPR/Cas12a-derived ultrasensitive biosensor" Xing W, Li Q, Han C [..] Zhang L. Talanta. 2023-01-31. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2023.124312 [著者所属] Nankai U, Institute of Basic Medicine and Cancer (浙江省)；グラフィカルアブストラクト

　アプタマーを利用することでCas12aのトランス切断活性（コラテラル活性）を介した非核酸分子の高感度検出が可能になった。中国の研究チームは今回、アプタマーの標的との親和性と、Cas12aトランス切断活性化との関係を解析し、Cas12aの活性化因子として機能するアプタマーの親和性と活性化能とのバランスをとる必要があることを、明らかにした。

SARS-CoV-2のスパイクタンパク質のサブユニットS1に対する新たなアプタマーを複数作製し、表面プラズモン共鳴測定から、親和性がナノモノ（nM）レベルであることを確認した。
同時に、Cas12aのトランス切断活性の活性化が配列に依存する「SET」効果（Sequence Essential Trans-cleavage activity）が存在することを発見した。
親和性が高ければ標的の認識能力が保証され、活性化能が高ければ十分なシグナル増幅が保証され、27塩基（27-nt）の最適化配列を同定し、電気化学的検出を組み合わせることで、SARS-CoV-2 S1の検出限界1.5 pg/mLを達成した。

　このCas12aをベースとするアプタセンサーは、ベータ、デルタ、およびオミクロン変異株の検出にも優れた性能を示し、また、他のタンパク質に対しても選択的である。さらに、唾液、尿、血清などの複雑な生体サンプルにおけるポイントオブケア検査（POCT）にも適している。

2. がん発症に関わるmiR-21検出：RNAを基質とするCas13aのコラテラル活性を利用して血漿中のエクソソームからの検出を実現

[出典] "Highly Effective Detection of Exosomal miRNAs in Plasma Using Liposome-Mediated Transfection CRISPR/Cas13a" Zhang J [..] Gao H, Zhang K. ACS Sens. 2023-02-01. https://doi.org/10.1021/acssensors.2c01683 [著者所属] Zhengzhou U, Henan Key Laboratory of Targeting Therapy and Diagnosis for Critical Diseases, State Key Laboratory of Esophageal Cancer Prevention & Treatment

　がん細胞由来のエクソソームのmiRNAは、がん診断のバイオマーカーとしての可能性を帯びている。しかし、エクソソーム中のmiRNAは極めて微量であるために、がんと関連する高感度・高精度なエクソソームmiRNAの検出は未だ研究課題となっている。

　中国の研究チームは今回、Cas13a/crRNAとレポーター（FAM-UUUUUU-BHQ1）を内包させたカチオン性リポソームとエクソソームの膜融合を経て、crRNAを介したmiRNA-21の認識とそれを介したLwaCas13aのトランスRNA切断活性 (コラテラル活性）によるシグナル増幅を介した血漿中エクソソーム内のmiRNA-21検出が可能なことを実証し、MFS-CRISPRとして報告した [Figure 1 参照]。ここで、MFSは膜融合戦略（membrane fusion strategy）に由来する。

MFS-CRISPRは、４桁に及ぶ直線範囲（10<4>-10<8> 粒子/mL）と、低濃度（1.2x10<3>粒子/mL）の検出を達成した。
リポソームを利用することで蛍光シグナルを融合したベシクル内に閉じ込めることができるため、MFS-CRISPRは血中エクソソームの不均一製の解析にも利用できる。
臨床サンプルでの実証実験では、乳がん患者と健常者のmiR-21に有意差があることを確認できた [Figure 7 参照]。

　MFS-CRISPRは、高感度なだけでなく簡便でもあることから、がん診断・治療モニタリングの臨床応用が期待される。

2023-02-03 =============

RNAの検出：Cas12aによりながらも、逆転写や鎖置換を介さずにRNAの直接検出を実現するSAHARA

[注] SAHARA: Split Activators for Highly Accessible RNA Analysis

[出典] "Programmable RNA detection with CRISPR-Cas12a" Rananaware SR [..] Jain PK. bioRxiv. 2023-01-30 [プレプリント] https://doi.org/10.1101/2023.01.29.525716 [著者所属] U Florida.

　Cas12aの本来の基質はDNAでありCas12aによるRNA検出には、逆転写酵素や鎖置換の前処理が必須とされていたが、フロリダ大学のグループが、RNA基質の直接検出を実現した。

crRNAのPAM近位「シード」領域がトランス切断を開始するためにDNAのみを認識する一方で、crRNAのPAM遠位領域または3'末端はRNAとDNAの両方の基質を許容できることを発見した。
この性質を利用して、短いssDNAやPAMを含むdsDNAをシード領域に供給するだけで、crRNAのPAM遠位領域のRNA配列を検出する方法を開発しSAHARTA（Split Activators for Highly Accessible RNA Analysis）と命名した [bioRxiv Fig. 3 Development of SAHARA for the detection of a wide range of RNA targets a.Schematic representation of Cas12a complexed with WT vs. SAHARA crRNA and activated by either a short (20-nt) or long (730-nt) RNA activators.参照]。
SAHARAはMg2+濃度およびpHに依存し、Cas12aの複数のオルソログに対して室温でロバストに作用することをが確認された。
また、SAHARAは野生型CRISPR-Cas12aに比べ、crRNAの特定の位置で標的認識の特異性が大きく向上していることも確認された。
SAHARAを用いることで、ピコモル濃度のmiRNA-155とC型肝炎ウイルスRNAを増幅なしで検出することに成功した。

　SAHARAは、PAM近位DNAをスイッチとして使用し、DNAとRNA両方の標的の検出のためにCas12aのトランス開裂活性（コラテラル活性）を制御することができる。これにより、プール型crRNA/Cas12a複合体ライブラリーを用いて、異なるDNAおよびRNAターゲットを検出する多重アレイを作製することができる。SAHARAはまた、Cas12a以外のCasタンパク質にも展開できる可能性がある。

[Nguyenらの先行研究論文] "Enhancement of trans-cleavage activity of Cas12a with engineered crRNA enables amplified nucleic acid detection" Nguyen LT, Smith BM, Jain PK. Nat Commun, 2020-09-30. https://doi.org/10.1038/s41467-020-18615-1 [著者所属] U Florida.

　Cas12aバイオセンサーは、核酸検出のための非常に大きな可能性を秘めているが、増幅のステップを経なければピコモル単位の検出限界にとどまっている。フロリダ大学の研究チームは今回、crRNAの改変と最適化された条件により、臨床に関連する様々な核酸ターゲットをより高感度に検出できるプラットフォームを開発し、標的核酸の前増幅ステップなしでフェムトモルレベルの検出限界を達成可能なことを報告した。

　また、crRNAの3′あるいは5′末端を異なる長さのssDNA、ssRNA、ホスホロチオエートssDNAで拡張することにより、LbCas12aのコラテラル活性が野生型crRNAの3.5倍にも亢進し、標的認識の特異性も大幅に改善されることを発見した。特に、crRNAの7-mer DNA延長（ENHANCE）がLbCas12aを介した核酸検出の感度と特異性を高め、これがスペーサーには依存せず普遍的でああることを見いだした。

　様々なcrRNAの修飾、標的の種類、レポーター、および2価の陽イオンを用いて、今回設計したENHANCEシステムの詳細な特性評価を実施し、SARS-CoV-2 RNAをRT-LAMPで等温増幅し、修飾したcrRNAをペーパーベースのラテラルフローアッセイに組み込むことで、40-60分以内に最大23倍の感度を得た。

2023-02-02 =============

病原菌 (黄色ブドウ球菌)の検出：Cas12aバイオセンサーにエバネッセント波蛍光ナノバイオセンシングを融合し、前増幅無しでの超高感度検出を実現

[出典] "CRISPR/Cas12a-powered evanescent wave fluorescence nanobiosensing platform for nucleic acid amplification-free detection of Staphylococcus aureus with multiple signal enhancements" Song D [..] Zhu A, Long F. Biosens Bioelectron 2013-01-31. https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115109 [著者所属] Renmin U China, State Key Laboratory of NBC Protection for Civilian (Beijing).

　大腸菌の検出システム"CHANCE (Cas12a-HCR evANescent wave fluorescenCE)"を報告した研究チームが今回、黄色ブドウ球菌を対象とする"CRISPR/Cas12a-powered Evanescent wAve fluorescence nanobiosensing plaTform (CREAT)"を発表した。

　CRISPR/Cas12aのコラテラル活性を利用するシグナル増幅に加え、ナノフォトニック構造を用いたエバネッセント波蛍光増強、Mg2+やDNAを介した蛍光増強、空気置換による蛍光増強の戦略を採用し、黄色ブドウ球菌の超高感度検出法CREATを実現した。特に、CREAT で検出される蛍光シグナルは、簡単な空気置換のステップを加えることで大幅に増強された。

　CREATは、黄色ブドウ球菌の検出限界、45分で592 CFU/mL、90分で13.2 CFU/mLを達成し、RT-qPCRに匹敵する検出感度を示した。

　CREATは、他の病原体の簡便、迅速、高感度、堅牢、柔軟なオンサイト検出に利用可能である。

2023-02-01 =============

複数低分子検出：抗原抗体反応 + Cas12a + 蛍光測定

[出典] "A universal CRISPR/Cas12a-powered intelligent point-of-care testing platform for multiple small molecules in the healthcare, environment, and food" Zhao Y [..] Zhang Z. Biosens Bioelectron. 2023-01-25. https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115102 [著者所属] Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hubei Hongshan Laboratory, Zhejiang Xianghu Laboratory

　中国の研究チームが、CRISPR Cas12aをベースとして、ヘルスケア、環境、および食品安全のための複雑なマトリックスにおける多様な低分子の迅速検査を実現するインテリジェントなポイントオブケア検査法（iPOCT）を開発した。

　概念実証実験として、アフラトキシンB1（AFB1）、ベンゾ[a]ピレン（BaP）、カプサイシン（CAP）を複数のターゲットとして選択した。まず、3つの抗原を独立したマイクロウェルにプレロードした。次に、抗体／抗原によって誘導された蛍光シグナルを、ビオチン／ストレプトアビジンを介してCRISPR／Cas12aシステムへ連続的に移した。第三に、蛍光シグナルは、スマートフォン制御のハンドヘルド・ダークボックスリードアウトによって記録された。最適化の結果，AFB1，BaP，CAPにおける検出限界は0.00257，4.971，794.6 fg/mLで，最大4桁の広い直線範囲となった。尿，水，大豆油，小麦，ピーナッツを複合マトリックスとして用いることで，HPLC-MS/MS法と比較して高い選択性，高い回収率，再現性，高い一致性を記録した。本研究は、脂溶性および水溶性マトリックス中の複数のターゲットに対する実用的なインテリジェントPOCTプラットフォームであり、ヘルスケア、環境、および食品安全のために広く応用されることが期待される。

2023-01-31 =============
一塩基変異の検出：PAMに制限されない簡便・迅速かつ普遍的で高感度なPCR-Cas12aバイオセンサー
[出典] "A universal and sensitive gene mutation detection method based on CRISPR-Cas12a" Wang H. Liu R [..] Zhang W, Wang X. Analytics Chimera Acta 2023-01-26 https://doi.org/10.1016/j.aca.2023.340886 [著者所属] Second Hospital of Jilin U, Huazhong U Science and Technology, Fudan U.；グラフィカルアブストラクト参照
　中国の研究チームは今回、ヘアピンプライマーを利用する高特異度のPCRにCas12aバイオセンサーを組み合わせることで、PAM配列の有無に関わらず臨床的に重要な3つの変異、PTEN R130Q、BRAF V600E、TP53 R248W、の検出限界0.1%を達成した。また、10件の臨床サンプルを対象とするTP53 R248W変異検出を検証し、100%の精度を達成した。

2023-01-30 =============
上咽頭癌由来エクソソームの検出：磁性ナノ粒子 (MNP) + (アプタマー) + TdT + Cas12a + 蛍光検出

[出典] "Fluorescent aptasensor based on the MNPs-CRISPR/Cas12a-TdT for the determination of nasopharyngeal carcinoma-derived exosomes" Yi P, Luo D, Gao Z, Chen Q, Zhou Y. Microchimica Acta 2023-01-26. https://doi.org/10.1007/s00604-023-05657-7 [著者所属] Huazhong U Science and Technology, Zigong Third People’s Hospital, Shenzhen Fuyong People’s Hospital, Shenzhen Baoan Authentic TCM Therapy Hospital；グラフィカルアブストラクト参照

　中国の研究チームが今回開発した蛍光アプタセンサーでは、まず、CD63抗体で修飾したMNPで血液サンプルからエクソソームを捕捉し、エクソソーム表面に発現しているPD-L1タンパク質にPD-L1アプタマーを結合させ、MNP/エクソソーム/アプタマーの複合体を構成する。次に、TdT（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）を介したアプタマーを伸長させ、ポリTの超長鎖を生成する。さらに、この一本鎖に複数のcrRNAが結合して、ポリT/crRNA/Cas12a複合体が形成され、Cas12aのトランス切断活性が駆動され、消光されていたDNAレポータが切断されて蛍光を発する。

　このセンサーは最適化条件下で、線形範囲 500～5×10<4>粒子/mL、検出限界 100粒子/mLと優れた感度・特異性を示した。また、臨床検体中のNPC由来エキソソームの定量が可能であり、臨床応用を期待できる。

2023-01-29 =============

血小板由来成長因子-BB（PDGF-BB）の検出で概念実証：CRISPR Cas12aをベースとするシリコン表面増強ラマン分光法（SERS）レシオメトリックチップによる高感度かつ信頼性の高い定量化

[出典] "CRISPR Cas12a-Powered Silicon Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Ratiometric Chip for Sensitive and Reliable Quantification" Cao H [..] Zhang X, Wang H. Anal Chem 2023-01-19. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c03990 [著者所属] Soochow U

　中国の研究チームはまず、均一なシリコンSERS基板を作製するために、マイクロ流体合成法を開発した。この方法では、マイクロ流体ガルバニックデポジション反応により、シリコンウェハー（AgNPs@Si）上に均一な銀ナノ粒子（AgNPs）をin situ 成長させ、次に、AgNPsを5′-SH-3′-ROX (6′-カルボキシ-X-ロドミン)標識した一本鎖DNAで修飾する。一方は相補的なDNA（5′-Cy3標識ssDNA）とハイブリダイズして二本鎖DNA（dsDNA）を形成し、ROX標識のもう一方の断片はCas12aの基質として伸長させる。

　PDGF-BBの有無によって、ROX標識断片のCas12aによる切断が制御される。一方、内部標準分子として機能するCy3分子は、dsDNAの末端に留まり、そのシグナルは一定である。こうして、ROXシグナル強度とCy3強度の比を利用して、PDGF-BBの濃度を確実に定量することができる。　

　開発したチップは、PDGF-BBの検出において超高感度（検出限界 3.2 pM；蛍光検出の約50倍の感度）および良好な再現性を実現した。

2023-01-28 =============

B型肝炎ウイルス（HBV）の検出：Cas12a + 金ナノ粒子プローブ + 表面増強ラマン分光法（SERS）

[出典] "Amplification-free detection of HBV DNA mediated by CRISPR-Cas12a using surface-enhanced Raman spectroscopy" Du Y, Ji S, Dong Q, Wang J, Han D, Tao Z. Anal Chim Acta. 2023-01-25. https://doi.org/10.1016/j.aca.2023.340864 [著者所属] Military Medical Sciences Academy Environmental and Operational Medicine Research Department, Xinjiang U；グラフィカルアブストラクト

　前増幅を利用することなく、50分以内のHBV DNAの定量的検出（検出範囲 0.1 pM~1 nM）を実現

2023-01-27 =============

エルシニア・エンテロコリチカの検出：新たな標的遺伝子を同定し、PCR/RAA + Cas12a + 蛍光/LFA

[出典] "Rapid fluorescence visualization of Yersinia enterocolitica by CRISPR/Cas12a using novel specific target obtained by pan-genome analysis" Zhong Y, Liu M [..] Wang J. LWT 2023-01-21. https://doi.org/10.1016/j.lwt.2023.114500 [著者所属] South China Agricultural U, Institute of Microbiology (Guangzhou), Jinan U；参考図 Fig. 1. Schematic diagram of the operation of the new target mining (A) and CRISPR/Cas12a system based on Y. enterocolitica (B).

　食中毒の重要な病原体であるY. enterocolitica の分子検出法についてはこれまでほとんど報告されていなかったが、これは、適切な標的遺伝子が同定されていなかったことが一因である。

中国の研究チームは今回はじめに、NCBIで公開されているゲノムデータベースを利用したパンゲノム解析により、Y. enterocolitica に特異的な標的遺伝子、YE5303_14291、を同定した。
続いて、YE5303_14291 ベースのPCR-CRISPR/Cas12aまたはRAA-CRISPR/Cas12aシステムと蛍光測定またはラレタルフローアッセイにより、Y. enterocoliticaの定量的検出を実現した。
線形範囲は3.1〜3.1 × 10<10>CFU/mLで、検出限界（LOD）は 3.1 CFU/mLであった。
いずれの検出系は十分な特異性を示し、実試料での検出結果が分離・培養での判定結果と一致した。

　YE5303_14291 遺伝子を標的とするCRISPR/Cas12a検出システムは、食品サンプル中のY. enterocolitica を特異的かつ迅速に検出する可能性を示した。

2023-01-25 =============
低分子検出：低分子アプタマー + HCR増幅+ Cas12a

[出典] "Sensitive Small Molecule Aptasensing based on Hybridization Chain Reaction and CRISPR/Cas12a Using a Portable 3D-Printed Visualizer" Ma L [..] Man S. ACS Sens. 2023-01-18. https://doi.org/10.1021/acssensors.2c02097 [著者所属] Tianjin U Science & Technology；グラフィカルアブストラクト　

　天津科学技術大学の研究チームが、SMART-Cas12a (small-molecule aptamer regulated test using CRISPR/Cas12a) という非核酸低分子検出のための汎用的なバイオセンシングプラットフォームを開発した。

このプラットフォームは、アプタマーがターゲットに結合することでハイブリダイゼーション連鎖反応カスケード信号増幅が引き起こされる。次に、CRISPR/Casシステムが増幅された産物を認識し、トランス切断が活性化され、蛍光シグナルを発する。
蛍光シグナルは、自作のアプリ付きスマートフォンを使って、カスタマイズした3Dプリンターで自作したビジュアライザーで容易に可視化・分析することができる。
モデル低分子としてATPを選択し、最適化した条件下で、0.1～750 μMの線形応答範囲と1.0 nMの検出限界という優れた分析性能を達成した。
また、複雑なサンプル環境に展開可能な選択性と回収率も示した。
サンプルから判定までの時間は100分未満であった。

2023-01-24 =============

前期破水妊婦におけるB群レンサ球菌（GBS）の迅速かつ高感度な検出法：RPA + Cas12a

[注] B群レンサ球菌（GBS）= Streptococcus agalactiae；前期破水 = premature rupture of membrane (PROM)

[出典] "CRISPR/Cas12a-based assay for the rapid and high-sensitivity detection of Streptococcus agalactiae colonization in pregnant women with premature rupture of membrane" Yu D, Liang B [..] Wu Z, Wang X. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2023-01-10. https://doi.org/10.1186/s12941-023-00558-2 [著者所属] Fujian Medical U, Fujian Maternity and Child Health Hospital, Fuzhou U.

　GBSは、新生児の罹患率と死亡率の主要な感染原因である。このため、早産婦のGBSを迅速かつ高感度に検出する方法を確立することが重要である。

　中国の研究チームは、PROM妊婦179名から採取した膣スワブまたは頸部スワブを対象にRPAとCas12aによる検出（CRISPR-GBS法）結果と、培養ベースのMALD/TOF MS法およびリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）アッセイの結果を比較検討した。

　CRISPR-GBS法は35分以内に完了し、検出限界は5コピーμ/Lに達した。CRISPR-GBS法は培養-MS法と比較して，感度96.64％（144/149，95％信頼区間［CI］92.39-98.56％），特異度100％（30/30，95％CI 88.65-100％）であった。また，qPCR法との一致率も98.88％と高かった．

　CRISPR-GBSプラットフォームは、迅速、正確、簡単な操作、コスト効率でGBSを検出することができる。また，CRISPR-GBSはGBSの産科内スクリーニングに有用なツールである．

2023-01-23 =============

抗菌薬SDMの検出：SDMアプタマー + Cas12aの活性化配列のロックと解放を担うEDC回路 + Cas12aコラテル活性 + 蛍光検出

[注] SDM（Sulfadimethoxine, スルファジメトキシン）; EDC（ entropy-driven catalysis, エントロピー駆動の触媒反応）

[出典] "Locking-DNA network regulated CRISPR-Cas12a fluorescent aptasensor based on hollow flower-like magnetic MoS2 microspheres for sensitive detection of sulfadimethoxine" Lv Y [..] Wang Z. Chem Eng J. 2023-01-16. https://doi.org/10.1016/j.cej.2023.141463 [著者所属] Jiangnan U, Chengdu U, Institute of Food Safety and Nutrition (Nanjing)

　SDMは、水産業や畜産業での過剰使用により、食の安全や人の健康を脅かす可能性がある。そのため、食品や環境中のSDMをモニタリングするための迅速かつ高感度な同定法が緊急に必要とされている。中国の研究チームは、SDM特異的アプタマー（SDMApt）が相補鎖Tに結合した認識プローブ（SDMApt-T）、Y字型のEDC増幅回路を含み、Cas12a活性化配列をロックするY字型スキャフォールドを組み込んだEDC増幅回路、およびCas12a-crRNA複合体の形成という3部構成（グラフィカルアブストラクト https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1385894723001948-ga1_lrg.jpg　参照）である。

　読み出しには、ssDNA-FAMのFRETエネルギー受容体として、多機能中空フラワーライクマイクロスフィアH-Fe3O4@MoS2を合成・利用して蛍光の消光を実現しておき、標的の存在下で、Cas12aのコラテラル活性によりssDNA-FMAが迅速に切断されることで、蛍光が復活する、仕組みを開発・利用した。

　ここで開発したロックEDC-Cas12aセンシング法によるアプタセンサーは、H-Fe3O4@MoS2の優れた消光特性と迅速な磁気分離、およびロックEDC-CRISPR-Cas12aのダブルシグナル増幅により、対数線形範囲0.005-100 ng/mL、検出限界2.86 pg/mLと優れた分析性能を示した。さらに、ロックEDC-Cas12aセンシング法の実用性と信頼性は、実試料中のSDMのスパイク回収実験によって検証された。

　したがって、本戦略は食品と環境の安全性のための有望な分析ツール候補となる。

2023-01-22 =============

カビ毒の一種オクラトキシンA（OTA）の検出：OTAの認識にアプタマーを利用し、エキソヌクレアーゼIIIを介した増幅にCas12aのシグナル増幅を加え、電気化学的に検出

[出典] "An electrochemical aptasensor based on exonuclease III-assisted signal amplification coupled with CRISPR-Cas12a for ochratoxin A detection" Wu C, Wang X [..] Wu L, Huang H. Food Control. 2023-1-16. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2023.109631 [著者所属] Nanjing Normal U, Agricultural Genomics Institute at Shenzhen, Zhejiang Laboratory

　2008年に報告されたOTA特異的結合アタブター (aDNA)を採用し、OTAが、二本鎖DNA（aDNA-cDNA複合体）中のaDNAにOTAが認識され、放出された捕捉DNA（cDNA）がヘアピンDNA（HP）とハイブリダイズし、新しい二本鎖DNAを形成、次に、Exo IIIを導入してこれを消化し、Exo IIIのサイクリング反応によって大量のトリガーDNA（tDNA）を作製、このtDNAが、CRISPR-Cas12aのコラテラル活性を活性化する。

　Cas12aのコラテラル活性によりガラス状炭素の電極に固定しておいたフェロセン基で修飾した一本鎖DNA (Fc-ssDNA)が切断され、フェロセン電気化学シグナルが急激に減少する。

　本手法は、スパイクされたピーナッツおよび米サンプル中のOTAを高感度で検出可能にした

2023-01-21 =============

冷凍エビからのSARS-CoV-2検出：RT-LAMP + Cas12a; 二重可視化

[出典] "CRISPR/Cas12a-Assisted Dual Visualized Detection of SARS-CoV-2 on Frozen Shrimps" Qian S [..] Xu J. Biosensors. 2023-01-14. https://doi.org/10.3390/bios13010138 [著者所属] Zhejiang U, State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-Products, Zhejiang Institute of Microbiology, Key Laboratory of on Site Processing Equipment for Agricultural Products.

　中国の研究チームが、冷凍エビにスパイクしたSARS-CoV-2の高感度・高信頼性の検査法を開発した [Figure 5引用挿入図参照]。SARS-CoV-2の標的RNAとコントロール用のMS2ファージをRNAを同時に増幅する二重カラーメトリックRT-LAMP反応を採用し，操作手順を簡略化した。

内部コントロールのMS2ファージをcolorimetric RT-LAMPで検出し、SARS-CoV-2 RNAはCas12aバイオセンサーでで検出する。
検出結果は、紫外線ランプの照射により目視で確認する。
SARS-CoV-2の標的遺伝子の検出限界は、20コピー/反応であった。
増幅時にウラシル（Uracil）を組み込むことで、アンプリコン汚染防止機構が組み込まれている。

　本検査は、綿棒、反応管、試薬などの使い捨て部品のほか、温度調節可能なヒーティングブロックと紫外線ランプのみで実施可能であり、税関、倉庫、スーパーマーケットなどの現場で実施可能な検査であると考えられる。

2023-01-20 =============

鉛イオンの検出：前増幅に替わるMnO2ナノザイムとCas12aをベースに比色検出

[出典] "Nanozyme-catalysed CRISPR-Cas12a system for the preamplification-free colorimetric detection of lead ion" Xu S [..] Wu L, Huang X. Analytics Chimica Acta. 2023-01-16. https://doi.org/10.1016/j.aca.2023.340827；グラフィカルアブストラクト

　一本鎖 DNA を介して磁気ビーズと結合させた MnO2 ナノザイムは、3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジンの色調変化を引き起こす強い酸化酵素様活性を持ち、CRISPR-CAS12a システムの測色シグナルプローブおよび触媒として調製されている。

　ナノザイムを触媒とする CRISPR-Cas12a システムにより、高い特異性と感度で、色調変化を介して Pb2+ を検出した。線形応答範囲は0.8 nM-2500 nMであり、検出限界は0.54 nMであった。本法は食品サンプル中のPb2+の検出に適用され，良好な精度と抗干渉性を示した。

2023-01-19 =============

TP53ホットスポット変異のin vitro 検出：Cas12aによるcrRNAシード領域を超えた位置での変異検出を実現

[出典] "In Vitro CRISPR-Cas12a-Based Detection of Cancer-Associated TP53 Hotspot Mutations Beyond the crRNA Seed Region" Kohabir KAV [..] Wolthuis RMF. CRISPR J 2023-01-13. https://doi.org/10.1089/crispr.2022.0077 [著者所属] Amsterdam UMC location Vrije Universiteit Amsterdam, Amsterdam Reproduction & Development, Cancer Center Amsterdam.

　TP53は、がんにおいて最も頻繁に変異するがん抑制遺伝子の一つであり、いわゆるホットスポットに繰り返し点変異が生じる。本研究では、Cas12aのシード領域外に位置するp.R273のコドンにおける6つのTP53ホットスポット変異をin vitro で検出するために、Cas12aベースのアッセイ条件を最適化し、4種類の市販Cas12a変異体の特異性を評価した。

　その結果、LbCas12aが合成DNA、モック無細胞DNA、組織生検において、目的とする変異のPAMからの距離が最適でないにもかかわらず、変異p.R273コドンを識別し、他のヌクレアーゼを著く凌駕することを見出した。

　Cas12aを用いた将来の臨床応用として、ポイントオブケア腫瘍分析、費用対効果の高い変異スクリーニング、個々の癌患者のモニタリングの改善などを期待できる。

2023-01-18 =============

[レビュー] CRISPR-Casシステムのトランス開裂活性の反応速度論とシグナル増幅の性能

[出典] REVIEW "Signal Amplification by the trans-Cleavage Activity of CRISPR-Cas Systems: Kinetics and Performance" Feng W, Zhang H, Le XC. Anal Chem. 2023-01-10. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c04555 [著者所属] U Alberta.

　本レビューは、文献に報告されているトランス開裂活性データを分析・比較することで、反応速度測定の詳細を説明し、Cas酵素のトランス開裂活性の正確な測定と正しい計算の重要性を強調する。

　Cas酵素の動態は複雑であり、複数の因子がトランス開裂の反応速度に影響を与えるが、個々の因子の詳寄与の詳細については十分に研究されていない。レビューでは、Casホモログ、crRNA配列、標的、レポーター、補因子、その他の反応条件、これら全てがトランス開裂活性および動力学に与える影響について議論する。高いトランス開裂活性とCRISPR-Casベースのシグナル増幅の全体的な性能を確保するための様々な戦略に優先順位をつけることができるように、他の増幅技術を組み込まないアッセイに議論を限定している。

[構成]

Cas12とCas13の機能に関する基礎知識

　Cas12aのヌクレアーゼ活性

　Cas13aのヌクレアーゼ活性

Cas酵素のトランス開裂反応速度の定量的決定（Michaelis-Mentenカイネティクスモデル）

　Cas12とCas13のトランス開裂速度論

　Cas12のトランス開裂反応速度を決定する因子

　Cas13のトランス開裂反応速度を決定する因子

Cas酵素のトランス開裂活性による核酸検出感度の向上

　トランス開裂反応速度と検出限界の関係

　機械学習による性能予測

生細胞におけるトランス開裂とシグナル増幅の課題

まとめと展望

2023-01-17 =============

ヒトパピローマウイルス18 (HPV-18)検出：Cas12aコラテラル活性に金ナノ粒子とMXene Ti3C2を介した電気化学的検出を組み合わせたE-CRISPR
[注] E = Electrochemical

[出典] "A CRISPR-Cas12a powered electrochemical sensor based on gold nanoparticles and MXene composite for enhanced nucleic acid detection" Duan H, Wang Y, Tang S-Y, Xiao T-H, Goda K, Li M. Sens Actuators B Chem. 2023-01-13. https://doi.org/10.1016/j.snb.2023.133342 [著者所属] Macquarie U (Sydney), U Birmingham, U Tokyo, UCLA, Wuhan U.

　E-CRISPRに広く利用されているバルク貴金属（例えば、金や白金）製の電極は、分析性能に限界があることと製造コストが高いことが難点である。オーストラリア, 英国, 日本, 中国の研究チームは今回、金ナノ粒子とMXene Ti3C2（2次元遷移金属カーバイドナノ材料の一種）を利用して、Cas12aコラテラル活性の結果を高い安定性と感度でシグナルとして伝達可能とするE-CRISPRを提案した。

　系統的な評価と最適化により、AuNPs/MXene Ti3C2ベースのE-CRISPRは、10 pMから500 nMの広い濃度範囲でヒトパピローマウイルス18 (HPV-18) DNAの定量と、1.95 pMの検出限界を達成した。

　さらに、センサーの選択性、耐劣化性、長期保存時の検出能力を評価した結果、AuNPs/MXeneを用いたE-CRISPRは2ヶ月後に初期電流の70%以上を維持し、42日間の保管でも影響を受けない信頼性の高い分析結果を呈した。

2023-01-16 =============

新型コロナウイルス検出：カスケード型鎖置換型増幅 ; Cas12aコラテラル活性によるシグナル増幅 + 電気化学的読み出し

[注] トーホールド配列を介した鎖置換反応 (Toehold mediated strand displacement reaction: TSDR)

[出典] "PAM-free cascaded strand displacement coupled with CRISPR-Cas12a for amplified electrochemical detection of SARS-CoV-2 RNA" Shi K [..] Song J. Anal Biochem. 2023-01-11. https://doi.org/10.1016/j.ab.2023.115046 [著者所属] Leshan Normal U, Leshan West Silicon Materials Photovoltaic and New Energy Industry Technology Research Institute；グラフィカルアブストラクト

　本手法では、まず、カスケード型TSDRにより、各ターゲットをシード領域にバブル構造を持つ複数のDNA基質へと変換することで、PAM非依存でターゲットとガイドRNA（gRNA）の直接ハイブリダイゼーションを実現し、CRISPR-Cas12aのコラテラル活性を起動する。その後、メチレンブルーで修飾されたヘアピンDNA（MB-HP）が活性化されたCRISPR-Cas12aによって切断され、これによって、MBが電極表面から遊離し、電流信号が減少する。この手法により、検出限界 40 aM を達成した。

　このバイオセンサーは、高い配列特異性、信頼性、頑健性を有し、PAMを使用しないカスケード型TSDRの採用により、CRISPR-Cas12aのgRNA配列を変更することなく、異なる標的RNAの普遍的な検出を実現する。本バイオセンサーはさらに、複雑な組成のサンプル中のSARS-CoV-2標的RNAの検出に成功しており、COVID-19の診断への可能性を示しています。

[関連論文]

"PAM-less conditional DNA substrates leverage trans-cleavage of CRISPR-Cas12a for versatile livecell biosensing" Chen S [..] Lei C, Huang Y, Nine Z. Chem Sci 2022-02-16. https://doi.org/10.1039/d1sc05558e [著者所属] Hunan U.

2023-01-13 =============

緑膿菌の検出：LAMP ＋ Cas12b ＋ssDNAレポーターをベースに１本のチューブと1回の液処理での検出を実現

[出典] "Accurate, Sensitive, and Rapid Detection of Pseudomonas aeruginosa Based on CRISPR/Cas12b with One Fluid-Handling Step" Qiu X, Liu X [..] Li Z. Microbiol Spectr. 2023-01-09. https://doi.org/10.1128/spectrum.03523-22 [著者所属] Chinese Center for Disease Control and Prevention, Wenzhou Medical U, Third Hospital of Shanxi Medical U, Capital Medical U

　37°Cから60°Cの温度範囲で活性を示すAlicyclobacillu acidophilus 由来のタイプ

V-B CRISPR/Cas12b（AapCas12b）を利用して、LAMP法からCas12bバイオアッセイまで55°Cで実行可能なCRISPR-top（CRISPR testing in one pot）法を開発した。CRISPR-topのLoDは10 コピー/反応混合物であり、呼吸器症状を有する患者から採取した喀痰46検体について、定量的リアルタイムPCRの結果に比して、感度85.3％（29/34），特異度100％（12/12），陽性適中率100％（29/29），陰性適中率70.6％（12/17）を示した．