- 細胞の生理学的履歴を観察することは、正常および疾病関連プロセスを理解する上で重要である - 
[出典] 
 2論文を刊行したNature Biotechnoloy 誌のNews & Views記事 Fig. 1: Molecular systems for recording transcriptional activityの左図にLinらの方式、右図にLinghuらの方式、の概念図が用意されている。左図には、一定の速度で成長し、EGFPやHaloTagなどの他のタンパク質を取り込む繊維状タンパク質鎖の模式図が描かれている。HaloTagを添加すると、結晶内の転写活性を色分けすることができ、その後の光学分析によって履歴を再構成できる。右図には、Linghuらの「発現を記録する島(expression recording island: XRI)」と称される繊維状タンパク質鎖の模式図が描かれている。このタンパク質鎖はDNA鎖にコードされており、一定の速度で着実に成長する。特定のエピトープタグを生成する転写活性がXRIに登録され、イベントのタイミングを測定することが可能になる。
[注] 以下、主としてこのNews & Views記事のテキストと2論文に準拠する。
 Nature Biotechnology から刊行されたLinらの研究 [*1]とLinghuらの研究 [*2] は、単一細胞における転写活性の履歴を追跡する技術にブレークスルーをもたらした。
 細胞の動態を高い時空間分解能で解析するこれまでのアプローチには明らかな限界があった。蛍光レポーターを介した生細胞の可視化では、顕微鏡の物理的制約から、観察可能な細胞が少数に限られる。この空間的制限は固定化組織の可視化によって克服できるが、そのアプローチだけでは、細胞内の活動の経時的変化を記録することは不可能である。LinらとLinghuらのアプローチは、これら2つのアプローチの長所を組み合わせたものと言える。
 2研究チームは、定常速度で成長するタンパク質繊維(ペプチド鎖)を用い、色素や蛍光タンパク質を用いて単一細胞内の転写イベントを「書き込み」、その後、タンパク質繊維を光学的に読んで、転写イベントの履歴を再構築する。
 近年、細胞内のDNA鎖を記録媒体として、CRISPR/Cas遺伝編集技術を介して細胞系譜を書き込み、後に、読み出し可能とするシステムが多数開発されているが、DNAを「読む」には細胞を溶解する必要があり、空間的な情報を別途記録し照合する技術が必要になる。一方で、LinらとLinghらのタンパク質鎖に基づくアプローチでは、空間的な情報も保持されるために、インタクトな組織内での細胞集団の活性のマッピングが可能になる。
 
[*1] タンパク質ペプチド鎖の'ティッカーテープ'に細胞の履歴を記録する
[出典] "Time-tagged ticker tapes for intracellular recordings" Lin D, Li X  [..] Cohen AE. Nat Biotechnol. 2023-01-02. https://doi.org/10.1038/s41587-022-01524-7 [著者所属] Harvard U, Institute for Protein Design, HHMI.
 ハーバード大学とワシントン大学のタンパク質設計研究所(所長 David Barker, 本論文の共著者の1人でもある)の研究チームがとったアプローチは、自然な結晶化現象に依存した'ティッカーテープ'方式である。
 セリン・スレオニンキナーゼPAK4の触媒ドメインとその内因性阻害剤iBoxの33残基からなる融合タンパク質iPAK4を哺乳類細胞で発現させると、細胞質内に棒状のタンパク質結晶が形成される。この結晶は、EGFPやHaloTag(HT)のような他のタンパク質を取り込むのに十分な大きさの中央チャネルを有している。著者らはまず、細胞内でEGFP-iPAK4とHT-iPAK4を発現させると、成長中の結晶繊維にHTとEGFPが取り込まれることを示した [Fig. 1 参照]
 各細胞におけるタイムスタンプの正確な色分けは、ユーザーが選択したHT-リガンド色素を添加することで実現される。HTと融合した目的のタンパク質が発現すると、色素と結合して成長中の結晶に取り込まれる。繊維は、ある色素を注入してから次の注入までの間にほぼ一定の速度で成長するため、その間に繊維に痕跡を残す転写活性のタイミングは、既知の色素注入時間から推測することができる。この特徴は、繊維の長さや成長速度が細胞間で不均一な実験環境において、細胞イベントの正確なタイミングを補間するために重要である。固定化後、色(色素や転写駆動蛍光マーカータンパク質)の位置を解析することができる。細胞間のばらつきは、個々の細胞における結晶成長速度の正規化によって補正する。
 この技術により、繊維成長の広域タイムラプスイメージングが、5〜10分の時間分解能で可能になった。しかし、この高い時間分解能は、記録時間というトレードオフを伴う。iPAK4結晶は細胞内で無限に成長することはできないため、イメージング時間は繊維の核形成から10~24時間である。記録時間の限界は細胞のコンテクストに依存する可能性が高く、さらなるが解析が必要である。
 Linらのアプローチには、小さな脳全体の活動マップを描ける可能性があるが、Linらは実際に、c-Fos誘導型EGFPタンパク質レポーターとテトラサイクリンを介したTet-ON転写を組み合わせたシステムで、単一神経細胞におけるプロモーター活性の定量化を実現した。

[*2] 細胞内の生理現象を光学顕微鏡で読み取り可能な自己組織化タンパク質鎖に記録する
[出典] "Recording of cellular physiological histories along optically readable self-assembling protein chains" Linghu C [..] Boyden ES. Nat Biotechnol 2023-01-02. https://doi.org/10.1038/s41587-022-01586-7 [著者所属] MIT (Brain and Cognitive Sciences, Biological Engineering, Media Arts and Sciences, McGovern Inst, K Lisa Yang Center for Bionics, Koch Inst, Center for Neurobiological Engineering, HHMI), U Michigan Medical School, Boston U, Kansas State U
 LinghuらMITを主とする研究チームは今回、細胞内の生物学的事象を継続的に細胞内に記録し、その後、固定細胞でのハイスループット読み出しを可能にする手法を報告した。
 近年、細胞内のDNA鎖を記録媒体として、CRISPR/Cas遺伝編集技術を介して細胞系譜を書き込み、後に、読み出し可能とするシステムが多数開発されているが、Linghuらは、自己組織化して長いフィラメントを形成することができる人工的なタンパク質サブユニットを設計し、この細胞内で伸長するタンパク質鎖のフィラメントを記録媒体とすることで、細胞系譜のデータを書き込み・読み出す手法を開発し、これをXRIexpression recording island/発現を記録する島)戦略と称した [Fig. 1引用挿入図 a 参照]。
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 これらサブユニットのうち1つは細胞内で継続的に生成され、もう1つは特定のイベントが発生したときにのみ生成されるように設計されている  [Fig. 1引用挿入図 b の上図参照:前者が青、後者が赤で表示されている]。また、サブユニットには、異なる細胞状態や機能(例えば、神経活動や薬物曝露の下流での遺伝子発現)に特異的であり、蛍光抗体と結合し光学顕微鏡でのサブユニット認識を可能にする蛍光を発するタグが組み込まれている。今回の概念実証実験では、HAとV5の2種類のタグを利用し、V5をc-fos  遺伝子の活性化に対応するサブユニットに割り当てた。
 研究チームはこの手法を利用して、培養神経細胞や生きたマウスの脳において、特定の薬理学的・生理学的刺激の下流における遺伝子発現のタイムコースを、数日から数週間という長期間にわたり、1日未満の時間分解能で記録することに成功した。

 [関連論文]
光学的細胞系譜追跡システム:インテグラーゼを書き込みツールとするintMEMOIR:"Imaging cell lineage with a synthetic digital recording system" Chow KHK, Buddy MW [..] Elowitz MB. Science 2021-04-09. https://doi.org/10.1126/science.abb3099 [著者所属] CALTECH, Spatial Genomics
 Chowらは、セリンインテグラーゼBxb1を用いて不可逆的なヌクレオチド編集を行うintMEMOIRと呼ばれる合成バーコードシステムintMEMOIRを開発した。
 IntMEMOIRと1分子蛍光in situハイブリダイゼーションを組み合わせることで、ハエの脳におけるクローン構成および遺伝子発現パターンを特定し、空間情報に紐付けたクローン解析と発現プロファイリングを実現した。細胞系統の関係を本来の組織のコンテクストの中で直接可視化するintMEMOIRは、発生や疾患の機序を理解を深めることになる。