[注] CAST (CRISPR-associated transposases/CRISPR関連トランスポザーゼ)；DSB (double-strand break)
[出典] "Targeted DNA integration in human cells without double-strand breaks using CRISPR-associated transposases" Lampe GD, King RT [..] Sternberg SN. Nat Biotechnol. 2023-03-29. https://doi.org/10.1038/s41587-023-01748-1 [著者所属] New York University Langone Medical Center；参考図 Fig. 1: Reconstitution of protein–RNA CAST components in human cells.
最近の研究では、Cas9に様々なトランスポザーゼ・ドメインを融合することで、RNA誘導トランスポザーゼの開発が試みられているが、これらの取り組みは、NHEJを誘導するDSBに依存し、そしてまたは、特異性の正確な制御を達成するに至っていない。一方で、細菌由来のCASTを利用することで、DSBを介さずに、大きなDNA配列を標的部位へ挿入可能なことが示されている。
Sernbergの研究チームはこれまでに、Vibrio cholerae Tn6677由来のI-F型CASTシステム（Vch CAST=Vch INTEGRATE）を利用することで、複数の細菌種においてDSBを回避しつつDNAを挿入可能なこと、このアプローチがゲノ全域にわたって高い特異性を示し、利用者が定義した部位に1-bpの精度で容易に挿入可能なことを、示した。このシステムでは、TniQとCascadeからなるリボ核タンパク質複合体（Vch QCascade）がRNAガイド下でDNAターゲティングを行い、トランスポゾンDNA挿入部位を決定する。切断と統合の反応は、AAA+ATPaseであるTnsCが事前に動員された後、TnsA-TnsBトランスポザーゼのヘテロマーによって触媒される [Fig.1 a参照]。研究チームは今回、QCascadeが、細菌に限らず、ヒト細胞にも適用可能なことを示した。
研究チームは、タンパク質の設計を通じてQCascadeによるDNAターゲティングを最適化し、AAA+ATPaseであるTnsCがQCascadeがターゲットとするゲノム部位に多価に動員されることを利用して、従来のdCas9ベースのCRISPRsと同レベルで強力な転写活性化を誘導する因子を開発した [Fig. 2: Development of QCascade-based and TnsC-based transcriptional activators to monitor DNA targeting 参照]。
プラスミドベースの統合を最初に検出した後、幅広い細菌宿主から15種類のCASTシステムを新たにスクリーニングし、改良された活性を示すPseudoalteromonas 由来のホモログを特定し、統合効率をさらに向上させることに成功した。
プラスミドベースの統合を最初に検出した後、幅広い細菌宿主から15種類のCASTシステムを新たにスクリーニングし、改良された活性を示すPseudoalteromonas 由来のホモログを特定し、統合効率をさらに向上させることに成功した。
最後に、細菌のClpXが、Muトランスポジションにおける既知の役割と同様に、統合後のCAST複合体の活発な分解を促進することによって、ゲノム統合を数桁も高めることを発見した。
こうして、真核生物のゲノムおよびトランスクリプトーム工学において、本研究は他のタイプI型CRISPR-Casシステムを利用した最近の研究 [＊]と合わせて、Cas9などの単一エフェクターに依存するゲノム編集に疑問を投げかけ、RNA誘導CASTによるゲノム工学の将来性を示唆するに至った。
[＊]
- 2019-11-19 ヒト細胞におけるゲノム編集を、タイプ I CRISPR-CasシステムCascadeで実現. https://crisp-bio.blog.jp/archives/20829994.html; "Harnessing type I CRISPR–Cas systems for genome engineering in human cells" Cameron C [..] Sternberg SH. Nat Biotechnol. 2019-11-18. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0310-0
- CRISPR転写活性化にタイプI-F Cascade-VPRはdCas9とdCas12a-VPRに優る. https://crisp-bio.blog.jp/archives/23421500.html; "Repurposing type I–F CRISPR–Cas system as a transcriptional activation tool in human cells" Chen Y, Liu J [..] Liang P, Songyang Z. Nat Commun 2020-06-19. https://doi.org/10.1038/s41467-020-16880-8
- 2019-09-25 ヒト細胞における遺伝子の転写活性化と抑制を、E. coli 由来Cascadeで実現. https://crisp-bio.blog.jp/archives/20067570.html; Targeted transcriptional modulation with type I CRISPR–Cas systems in human cells. Pickar-Oliver A [..] Gersbach CA. Nat Biotechnol. 2019-09-23. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0235-7
- 2019-04-10 Cas9はスイスアーミーナイフ、Cascade-Cas3は自走するシュレッダー. https://crisp-bio.blog.jp/archives/16949725.html; "Introducing a Spectrum of Long-Range Genomic Deletions in Human Embryonic Stem Cells Using Type I CRISPR-Cas” Dolan AE [..] Ke A, Zhang Y. Mol Cell. 2019-04-08. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.03.014
- CRISPRメモ_2019/10/24 [第4項] I-E CRISPR-Cascadeを植物の遺伝子活性化に活用する. https://crisp-bio.blog.jp/archives/20484799.html; "The repurposing of type I-E CRISPR-Cascade for gene activation in plants. Young JK, Gasior SL [..] Barrangou R. Commun Biol. 2019-10-18. https://doi.org/10.1038/s42003-019-0637-6
[関連crisp_bio記事]
2023-01-19 Nature Methods誌 注目の技術「大規模なDNAカーゴを組み込む技術」https://crisp-bio.blog.jp/archives/31315972.html；Method to Watch "Loading large DNA cargoes - CRISPR systems can be leveraged to direct recombinases to integrate gene-sized DNA sequences -" Tang L. Nat Methods 2023-01-12. https://doi.org/10.1038/s41592-022-01734-6
[20201124更新] INTEGRATE: Tn様トランスポゾンをベースとして、バクテリアゲノム編集の効率化と多重化を実現. https://crisp-bio.blog.jp/archives/23669855.html；"CRISPR RNA-guided integrases for high-efficiency, multiplexed bacterial genome engineering" Vo PLH [..] Sternberg SH. Nat Biotechnol. 2020-11-23. https://doi.org/10.1038/s41587-020-00745-y
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