[出典] "Programmable protein delivery with a bacterial contractile injection system" Kreitz J [..] Zhang F. Nature 2023-03-29 https://doi.org/10.1038/s41586-023-05870-7 [著者所属] HHMI, Broad Institute, McGovern Institute, MIT
[参考] "NEWS AND VIEWS "Mix-and-match tools for protein injection into cells” Ericson CF, Pilhofer M. Nature 2023-03-29. https://doi.org/10.1038/d41586-023-00847-y参考図 Figure 1 | Re-engineering of a contractile injection system from bacteria. 
 著者らは典型的なeCISであるPhotorhabdus virulence cassette (PVC) のテール・ファイバーの遠位結合要素が、標的細胞膜の受容体を特異的に認識することを発見し、さらに、タンパク質構造予測AI "AlphaFold"による解析と設計を利用してテール・ファイバーの構造を改変することで、PVCにとって非ネイティブなヒト細胞やマウスなどを、100%に近い効率で標的可能にするようPVCを再プログラムできることを示した。
 具体的に、PVCを介して、Cas9、塩基編集、毒素などの多様なタンパク質をヒト細胞やマウスに送り込み、それぞれに機能することを実証した。例えば、精製したPVCを、マウスの脳の海馬領域に直接注入することで、注入部周辺にのみ、ペイロードとしたタンパク質の蛍光シグナルが観測され、PVCの注入は局所的な免疫細胞の活性化を引き起こさず、また、PVCは脳内注入から7日後には非検出となることを発見し、PVCが遺伝子治療やがん治療、生物制御に応用可能なプログラマブルなタンパク質送達デバイスであることを示した。
 [背景]
 共生細菌にとって、宿主の生態を変化させる因子を分泌することは、共生細菌に有利に働くことが多い。しかし、このような因子の多くは細胞膜を容易に通過することができないため、ペイロードであるタンパク質を積極的に細胞内に送り込む複雑なシステムが進化してきた。その一例が、バクテリオファージのテールに似たシリンジのようなナノマシンの一種である収縮性注入システム(contractile injection system: CIS)である。
 CISは、収縮性の鞘 (sheath) と硬い内腔で構成される高分子複合体であり、ベースプレートに固定され、研ぎ澄まされたタンパク質(スパイク)を備えている。ペイロードは、スパイクの後ろに位置する内管の内腔に装填されるか、内管と融合タンパク質を形成するか、スパイク自体に結合すると考えられ、標的細胞が認識されると、鞘の収縮によって膜を通過させられる。
 CISが生物圏全体に広がっている。CISは、細菌膜に固定され、タイプVI分泌システム(T6SS)として知られる接触依存性の送達システムになることもあれば、シアノバクテリアのチラコイド膜(tCIS)に付着して細胞ストレス応答時に活性化することもある。また、細胞から遊離する細胞外収縮性注入装置(Extracellular contractile injection systems: eCIS: eCIS)として生成されペイロードを送達するナノマシンも存在する。
 eCISは細菌やアーケアに広く分布し、少なくとも6つのサブファミリーに分類されている。eCISによって、宿主細胞骨格の調節、DNA切断、宿主毒性などの多様な機能を帯びたペイロードが送達されることが明らかにされてきた。その中で近年、eCISはマウス細胞を標的とすることが明らかにされ、これらのシステムを真核生物細胞に機能性タンパク質を送達するツールとして利用できる可能性が出てきた。しかし、ヒトの細胞を標的とするeCISの活性が確認されたことはなく、eCISが標的細胞を認識する仕組みの解明が待たれていた。
 [大腸菌におけるeCISの再構築とエンジニアリング]
 著者らは今回、eCISの1つのサブタイプであるPVC [crisp_bio参照]に着目し、その活性を調べた。PVCは、昆虫病原性線虫の内部共生生物として存在するPhotorhabdus属のメンバーによって生産されるeCISである。PVCは、機能的な注入システムの構築に必要な16のコア遺伝子(pvc1-16)を含む約20kbのオペロンで構成されている  [Fig. 1a 参照]。pvc1-16の直下に、ペイロードであるPdp1とPnfが存在し、他のeCISと同様に、PVCの鞘の収縮とその後のスパイク・内管複合体の分解を介して標的細胞に入ると考えられている [Fig. 1b 参照]。
 著者らはまず、先行研究の手法に倣って[Jian F et al, Cell 2019 ] P . asymbiotica ATCC 43949からPVC(PVCpnf)を生産する大腸菌を作製した。下流の操作を容易にするため、PVCシステムを構造およびアクセサリー(pPVC)およびペイロードおよび調節(pPayload)プラスミドとに分割した。得られたタンパク質複合体は、約116nmの長さを持つ無傷のベースプレートと鞘構造を含む標準的なeCISに似ていた[Fig. 1c 参照]。最後に、これらの精製複合体を培養したSf9昆虫細胞 [この細胞株はPVCpnf24が内因的に標的とする昆虫との関係から選択] に短時間曝露し、細胞表面に強固に結合することを確認した [Fig. 1d 参照)。すなわち、大腸菌を使用して、適切なアセンブリとターゲティングを備えたPVC複合体を製造できるこが実証された。
 そこで、ポリ塩化ビニルをベースにプログラマブルなタンパク質送達デバイスとして開発するために、新規の非ネイティブなペイロードをポリ塩化ビニルに搭載することを試みた [Fig. 1e参照]。PVCがペイロードを取り込むメカニズムは完全には解明されていないが、PVCに内在するペイロード・タンパク質のN末端にある高度に無秩序な領域が取り込みプロセスに関与していることが明らかにされた。著者らは、この無秩序領域を欠損した改変ペイロードがPVCにロードされないことを確認し、この領域が、ペイロードをPVC複合体にロードするために必要な「パッケージング・ドメイン」であることを示した。
 続いてこのパッケージングドメインを、自然界ではPVCにロードされない様々なタンパク質(GFP、Cre、ジンクフィンガーヌクレアーゼ)と融合させ、得られた工学的ペイロードがPVCにロードされるかどうかをテストした[Fig. 1e 参照]。その結果、pvc15(ペイロードのロードに必要なATPase3)の存在下で、3つの非ネイティブ・ペイロードがすべてPVCと共精製され、この方法(パッケージングドメインのN末融合)が新規タンパク質をPVC粒子にロードする汎用的な戦略であることが確認された。
 最後に、培養昆虫細胞において、PVCによるタンパク質の送達を、内在性および人工のペイロードを問わず、直接観察することができるかどうかをテストした。ネイティブな毒素を搭載した未修飾のPVCとSf9細胞をインキュベートしたところ、強い細胞毒性が確認された [Fig. 1f 参照]。特に、この表現型で、いくつかの重要なPVC遺伝子の存在が必要であることをを同定し、さらに、別々に精製したペイロードやロードしていないPVC複合体を投与しても、この表現型の再現が不十分であり、観察された活性がPVC複合体と毒素ペイロードの両方の作用を必要としていることが示された。
 さらに、Creレポーターシステム(loxP-GFP)を保有するSf9細胞に投与したところ、[Fig. 1e参照]に記載した方法でCreを人工的に搭載したPVCがGFPシグナルを発した[Fig.1g 参照]ことから、新規タンパク質ペイロードをPVCを介して機能的に送達できることが明らかになった。
 これらの結果は、組換えPVCが培養昆虫細胞に対して生物学的に活性であり、非ネイディブタンパク質を標的細胞に負荷し、送達するように再プログラムして、新しい生物学的活性をもたらすことができることを示した。
 [標的をSf9細胞からマウスとヒト細胞へ]
 PVCが標的細胞に結合する分子機構は不明である。しかし、PVCが似ているT4ファージが標的細胞を認識する分子機構は解明されている。T4ファージは、ベースプレート複合体から伸びる6本の長いテール・ファイバーを持ち、宿主細胞表面のリポ多糖分子や外膜タンパク質と可逆的な相互作用をする. この過程により、ファージは標的細胞の上方で正しい方向に配置され、ベースプレートが細胞表面に十分近づいて不可逆的に結合し、ファージゲノムが細胞内に注入されるようになる。
 多くの研究により、ファージやその他の細菌を標的とするCISのテール・ファイバーに変更を加えるだけで、予測可能な方法で標的の特異性が変化することが示されている。そこで、著者らはファージに倣ってPVCの標的特異性を変化させることを試みた。特に、PVC遺伝子座には、T4ファージの短いテールファイバーの受容体結合先端と類似した予測ドメインを持つテールファイバー遺伝子(pvc13)が存在する。注目すべきは、PVCテール・ファイバーはファージ・テール・ファイバーと異なり、真核生物ウイルス(特にアデノウイルス)の受容体結合タンパク質にマップされる領域もしばしば含んでおり、PVCテールファイバーが真核生物の認識に関与しているという仮説が支持されている点である。また、PVCテール・ファイバーは、ファージと同様の方法でベースプレートに接続し、鞘に沿って上方に折り畳まれることが示されている。これらのことから、テール・ファイバーは標的認識に関与している可能性が高く、PVCの標的特異性を操作するために利用できる可能性があることが示唆された
 そこで、PVCテール・ファイバータンパク質(Pvc13)を改変することで、トロピズムを変化させ、ヒト細胞のターゲティングを可能にできるかどうかを検証した。
 AlphaFoldを用いて、Pvc13の遠位先端部(標的細胞と最初に接触すると考えられる領域)の立体構造を予測した [Fig. 2a 参照]。三量体としてみると、Pvc13のC末端は、球状の先端を持つらせん状のチューブ構造を形成し、これが全体のテール・ファイバーの結合ドメインであると考えられた。著者らは、この遠位結合ドメインの結合特性を変えることで、他のCISのテール・ファイバーと同様に、PVCのトロピズムに予測可能な変化をもたらすことができると仮定した。
 この仮説を検証するために、ヒト細胞に特異的な新規結合ドメイン(ヒトアデノウイルス5(Ad5)の三量体ノブ・ドメインまたは上皮成長因子受容体(EGFR)特異的アンキリン反復タンパク質(DARPin)E0139)をPvc13の推定C末結合領域に挿入(それぞれPvc13-Ad5-knobまたはPvc13-E01-DARPinとして生成)、このPVCがヒト細胞を標的とできるかどうかを評価した。この実験では、EGFRを過剰発現し、Ad5感染に感受性が高いことが知られているA549ヒト肺腺がん細胞をモデル細胞株として使用した。Pvc13-Ad5-knobまたはPvc13-E01-DARPinを搭載したPVCは、図1eに記載したように、ネイティブ・トキシンPdp1およびPnfを搭載するとA549細胞を効率的に殺傷し、Pdp1-NTD-Cre(Pdp1のN末ドメイン(NTD)にCreを融合)を搭載するとA549 loxP-GFP細胞にCre駆動の高効率GFP発現がもたらされた。最後に、Pvc13-Ad5-knobまたはPvc13-E01-DARPinを保有するPVCがヒト細胞の表面にクラスター化することを発見し [Fig. 2a、下]、観察された活性は、操作したPVCと標的細胞間の新規結合相互作用の結果であることが示唆された。
 これらの結果から、Pvc13はPVCのトロピズムを決定する要素であり、このタンパク質を改変することで、このシステムの標的特異性を予測可能に変化させることができることが示された。