[出典] "Genome-wide tiled detection of circulating Mycobacterium tuberculosis cell-free DNA using Cas13Thakku SG [..] Hung DT. . Nat Commun. 2023-03-31. https://doi.org/10.1038/s41467-023-37183-8 [著者所属] Broad Institute, Stanford U School of Medicine, Stanford Health Care, MIT, Koch Institute for Integrative Cancer Research, Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital, Stellenbosch U (南アフリカ).

 血中を循環する微生物由来のcfDNAの検出が、微生物感染の診断のための有望な新しいアプローチとして登場してきた。cfDNAに基づく微生物感染診断には、希少で高度に断片化された病原体由来の核酸を検出可能とするアッセイが必要であるBroad/HMS/MGHのDeborah T. Hungが率いる研究チームが今回、少量の病原体cfDNAを検出可能としたWATSON (Whole-genome Assay using Tiled Surveillance Of Nucleic acids) を報告した。

 研究チームはこれまでに、SHERLOCKをマイクロ流体プラットフォーム (DropArray) に適応させたCARMEN (Combinatorial Arrayed Reactions for Multiplexed Evaluation of Nucleic acids) を開発してSARS-CoV-2ウイルスを含む170種類のウイルスの多重検出を実現し [*1]、続いて、CARMENをバクテリア病原体52種類の検出へと展開したbCARMENを報告 [*2]していた。しかし、感染時の血中cfDNA中の病原体核酸の存在量は、採取されであろうサンプル量 (50~5000μL) あたり1ゲノム当量よりはるかに少ないとみられ、病原体核酸の検出感度を向上させる必要があった。

 研究チームは、WATSON血中病原体cfDNAの検出の実現に向けてSHERLOCKの感度を最大化するために、WATSON(Whole-genome Assay using Tiled Surveillance Of Nucleic acids)と名付けた方法を開発した。
SHERLOCKを、プール型増幅に続いて、病原体ゲノム上に並んでいる多数の標的配列を同時に検出するタイリングの手法を使って適応させた [Fig. 1引用右図 a の右側]。病原体ゲノムが1ゲノム当量未満の濃度で存在する場合、あるゲノム遺伝子座は存在するが、他の遺伝子座は存在しないことがある。複数のゲノムの標的を狙うことで、サンプル中に少なくとも1つの標的が検出される確率を高め、サンプル中にこれらの配列のいずれかが検出されれば、病原体が存在するとみなすことができる。これにより、1サンプルあたり1ゲノム相当という限界値をはるかに下回る病原体の検出が可能になる。
タイリングされた検出ステップは、多数の並列CRISPR/Cas13検出反応によって [挿入図 a のWATSONの下左]、あるいは単一のプールされた検出反応によって [挿入図 a のWATSONの下左]行うことができる。

 WATSONの性能は、結核の原因菌である結核菌由来のcfDNA検出で証明された。活性肺結核の診断は現在、しばしば質の高いサンプルを採取できない患者からの病原体を含む喀痰の採取に大きく依存している。そのためWHOは、あらゆる結核を検出する、喀痰を用いない迅速なバイオマーカーに基づく検査法の開発を求めていた [J Infect Dis, 2019 ]。

 WATSONは、人工のサンプルに対して、シングルプレックスSHERLOCK (単一遺伝子座を標的とする)よりも感度が高いだけでなく、タイリング増幅・検出戦略によって活動性肺結核患者の病原体cfDNAを検出できることを実証した。最後に、結核のような感染症に対する診断の現実的な必要性を考慮し、WATSONを現場で展開可能なラテラル・フロー・プラットフォームに変換する可能性も示した。
 
[*] CARMEN関連論文とcrisp_bio記事
  1. CARMEN "Massively multiplexed nucleic acid detection with Cas13" Ackerman CM, Myhrvold C [..] Blainey PC, Sabeti PC. Nature 2020-04-29. ;2020-08-09 CARMEN-Cas13: SHERLOCKを新型コロナを含むウイルス170種類の多重判定へと展開
  2. bCARMEN "Multiplexed detection of bacterial nucleic acids using Cas13 in droplet microarrays" Thakku SG, Ackerman CM [..] Hung DT. PNAS Nexus 2022-04-15. 
  3. "Multiplexed CRISPR-based microfluidic platform for clinical testing of respiratory viruses and identification of SARS-CoV-2 variants" Welch NL [..] Sabeti PC, Myhrvold C. Nat Med 2022-02-07. ;2022-02-16 mCARMEN: 呼吸器系ウイルスの臨床検査およびSARS-CoV-2変異系統の同定を実現する多重化CRISPRベースとするマイクロフルイディックプラットフォーム.