[出典] "Targeted In Vivo Mutagenesis in Yeast Using CRISPR/Cas9 and Hyperactive Cytidine and Adenine Deaminases" Skrekas C, Limeta A, Siewers V, David F. ACS Synth Biol. 2023-07-24. https://doi.org/10.1021/acssynbio.2c00690 [著者所属] Chalmers U Technology, Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability (TUD)；
指向進化法は目的とする特性を備えたタンパク質を創製するに有用なアプローチでありこれまでに、ランダム変異導入法, 標的変異誘発法や飽和突然変異誘発法、in vitro とin vivo といったカテゴリーの中で、エラープローンなPCR、DNAシャフリンング、CRISPR-Cas9などの技術が利用されたきた。
スエーデンとデンマークの研究チームは今回、制御された指向性進化アプローチに応用可能なin vivo標的変異誘発に役立つ、酵母S. cerevisiae in vivoで利用可能なCRISPRベースのツールを開発することを目的とした。そのために、研究チームは、制御された誘導可能な条件下で、選択したgRNAに誘導されて、目的のゲノム遺伝子座を変異させる塩基エディターを選択した。
はじめに、高活性シチジンデアミナーゼAID*Δ、高活性アデニンデアミナーゼTadA8e、およびその低オフターゲット活性バリアントTadA8eV106WとdCas9との融合体である塩基エディターのDNAレベルとフェノタイプレベルでの変異誘発効率と編集ウインドウを評価した [*]。また、遺伝子編集や遺伝子発現制御アプローチで効率的であることが証明されているエンドリボヌクレアーゼCsy4を介したgRNA多重化の手法を利用して、複数のgRNAが発現させた場合に、これらの塩基エディターがどのように作用するかを評価した。
本研究で評価した塩基エディター、関心のある遺伝子の全長に加えて選択されたドメインを対象とする指向性進化にも利用可能であり、また、目的の遺伝子をカバーする小規模なgRNAライブラリ (単一あるいはマルチプレックス) と組み合わせることが可能である。なお、突然変異誘発効率がgRNAに依存することが明らかになったことから、in vivo 指向性進化実験を設計する際には、変異導入すべきDNA領域を十分にカバーするgRNAライブラリーを用意することが重要である。
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