AcrIIC4がR-ループ形成の阻害を介してタイプII-C CRISPR-Cas9を無力にする構造基盤 : crisp

[出典] "AcrIIC4 inhibits type II-C Cas9 by preventing R-loop formation" Sun W, Cheng Z, Wang J [..] Wang Y. PNAS 2023-07-26. https://doi.org/10.1073/pnas.2303675120 [著者所属] Key Laboratory of RNA Biology (Institute of Biophysics CAS), National Laboratory of Biomacromolecules (Institute of Biophysics CAS), U CAS.

　抗CRISPRタンパク質 (以下、Acrs) は、CRISPR-Casシステムの天然の阻害剤であり、CRISPR-Casシステムのブレーキとして期待されている。Acrsのメカニズムを解明することは、バクテリオファージと宿主との間で進行中の進化的軍拡競争に光を当て、新たなCIRPR-Casシステムを制御するツールの開発を促進する可能性がある。

　AcrIIC4は、高い阻害力と幅広い阻害スペクトルを持つユニークな酵素であり、最初にパラインフルエンザ菌 (Haemophilus parainfluenzae: Hpa) ファージから分離され [＊1]、これまでに２つの研究チームがAcrIIC4単独の構造を報告している [＊2、3]。1つの構造は、AcrIIC4は4つのヘリックスのヘリカルバンドルで形成される単量体であり [＊2]、もう1つの構造は対照的に、AcrIIC4はホモ二量体であり、単量体は、1つの長いα-ヘリックスと2つの短いα-ヘリックスで形成されていた [＊3]。また、AcrIIC4の作用機序についても、2つの研究 [＊1、2]は電気泳動移動度シフトアッセイ (EMSA)を用いて、標的DNAの結合を阻害することによってAcrIIC4がCas9活性を阻害することを示唆したが、最近の研究 [＊3]では、DNA結合は阻害されず、代わりにAcrIIC4がDNA結合後のHNHヌクレアーゼドメインの動きを阻害する可能性が示唆された。

　本研究は、AcrIIC4が非常に柔軟な長いらせんを持ち、Cas9のRECローブに結合することを示している。この結合を介して、AcrIIC4はR-ループ形成を効果的に阻止し、Cas9の活性化を阻害する。また、先行研究の単独のAcrIICの2種類の構造の不一致については、遊離状態のAcrIIC4は溶液中では単量体として存在し、非常に長い62aのヘリックスを含んでいることが、もたらしたものと考えられる。Cas9との結合後、長いヘリックスはその中間領域を通って折り返され、コンパクトなコンフォメーションをとる。

AcrIIC4はHpaCas9のREC1ドメインとREC2ドメインの間の隙間に位置し [RCSB.orgから取得した右図構造図の右側参照]、その広範な相互作用によってREC2ドメインの可動性が制限され、PAM遠位端における標的二本鎖DNAの巻き戻しが阻害されることが明らかになった。したがって、AcrIIC4の存在下では、全長ガイドRNAと標的DNAとのヘテロ二重鎖、ひいてはCas9による標的切断が進行するに必須のDNAR-ループが形成されず、Cas9ヌクレアーゼの活性化を妨げられるというAcrIIC4独特のCas9不活性化機構が明らかになった。