１．Floxマウスの効率的作出

[出典] Horii T, Morita S, Kimura M, Terawaki N, Shibutani M, Hatada I.

“Efficient generation of conditional knockout mice via sequential introduction of lox sites.” Sci Rep. 2017 Aug 11;7(1):7891.

• Cre/loxを利用した条件付きノックアウトマウス（floxマウス）は、遺伝子機能解析に欠かせない研究資源である．CRISPR/Cas9を利用すると、２種類のgRNAsと一本鎖オリゴヌクレオチド（ssODN）により、ノックアウト標的遺伝子のエクソンの両側２箇所に同時にlox配列を挿入し（以下、同時法）、標的遺伝子の条件付きノックアウトが可能になる（挿入図 Figure 1-a）．しかしこの同時法では、同一染色体の２箇所で発生するdsDNA切断（DSB）が染色体欠失を誘発し、結果的にfloxマウス作成成功率が著しく低くなる．
  
• 今回、群馬大学生体調節研究所ゲノム科学リソース分野の研究チーム（堀居拓郎、森田純代、木村美香、寺脇直美、澁谷海大、畑田出穂）は、CRISPR/Cas9によりlox挿入を２箇所へ、１細胞期と２細胞期に順次挿入する手法（挿入図 Fgiure 1-b；以下、順次法）を発想し、CRISPR/Cas9システムのマイクロインジェクションとエレクトロポレーションによる最適化を試みた．
• その結果、エレクトロポレーションを利用する順次法により、2種類の遺伝子座（Mecp2/Tet3）を標的とする実験で、floxマウス出現確率がそれぞれ同時法の〜３倍/〜7.3倍となり、また、染色体欠失率がそれぞれ４分の１/７分の１となる結果を得た．
  
• さらに、Creを形質導入したマウス受精卵にエレクトロポレーション順次法を適用し、胚移植を介して、受精卵から直接Floxマウスを作出することに成功した（挿入図 Figure 2-a）．
  
• 順次法は、必要な部品（Cas9、gRNA、ssODNなど）は全て購入可能、エレクトロポーレションはスケーラブル、および交配を介さずflox化可能というメリットがあり、ラット、ブタ、ウサギなどに展開可能であり、さらに、FLP/FRTを含む他の部位特異的組換えシステムにも拡張可能である．

２．RCas9/TVA-CRISPR/Cas9複合システムによる遺伝子編集で、精密な腫瘍モデルを構築

[出典] Oldrini B et al. “Somatic genome editing with the RCas9/TVA-CRISPR/Cas9 system for precision tumor modeling.” bioRxiv Posted August 14, 2017.

RCas9/TVA-CRISPR/Cas99複合システムにより、神経幹細胞に腫瘍抑制因子（Trp53; Cdkn2a; Pten）欠失とドライバーオンコジーン発現を導入し、高悪性度グリオーマ形成；さらに、gRNAsペアを利用することで染色体領域欠失と染色体転位を導入し、in vitroとin vivoで形質転換能を確認；また、グリオーマの様々なサブタイプで高頻度で存在するBraf V600E変異を、HDRを介して構築．

[注] RCas9/TVA：The RCas9 System (Hughes Lab Web site/NCI)