[出典] "Structural basis for the activation of a compact CRISPR-Cas13 nuclease" Deng X, Osikpa E [..] Gao X, Gao Y. Nat Commun. 2023-09-20. https://doi.org/10.1038/s41467-023-41501-5 [著者所属]  Rice U.
 
 CRISPR-Cas13リボヌクレアーゼは、その高いプログラム可能性と標的特異性から、RNAノックダウンと転写調節に広く応用されている。しかし、臨床への応用に対しては、遺伝子治療に利用されてきたAAVで送達するにはそのサイズが大きすぎることと、標的RNAを認識すると活性化する非選択的RNA切断活性 (コラテラル活性) が、障害となっていた。その中で、AAV送達に適したコンパクトなCas13bt3が発見された [*1]

 Cas13bt3の構造については、先行研究 [*2] にて、Planctomycetes bacterium 由来のCas13bt3 の二次元複合体と三次元複合体の構造が解かれ、Cas13bt3のHEPN1ドメインとHEPN2ドメインが、標的との結合時に24Åにわたって一体となって動くことが明らかにされた。しかし、2つのHEPNドメインはどちらの構造でも互いに同じコンフォメーションをとっており、このHEPNドメインの剛体運動がどのようにヌクレアーゼ活性化を引き起こすのかは不明であった。さらに、Cas13bt3の三元複合体は、25 ntと短い標的RNAに結合した状態であるが、この条件は、Cas13bt3の最適な活性化をもたらさない。そこで、ライス大学の研究チームは、生体内RNA編集への応用に向けて、高度に特異的なCas13bt3変異体を合理的に設計することを目的として、さらなる構造的・機構的研究に取り組んだ。

 今回、生化学的には、Cas13bt3は内部の "UC "部位で標的RNAと非特異的RNAを切断し、標的の長さに依存した活性化を示すことが明らかになった。構造の観点からは、活性化されたCas13bt3とcrRNAおよび30 nt標的RNAとの複合体の構造を、クライオ電顕を利用して3.5Åで決定し、これまでの構造と比較して、HEPNヌクレアーゼドメインが標的RNAに沿ってほぼ50Åの標的の長さに依存する移動を示した。HEPNドメインの移動と相まって、HEPNドメインとcrRNA結合ドメインを橋渡しする2つのドメイン間リンカー (IDL) が完全に伸長し、標的RNAの結合とCas13bt3の活性化に重要な新しい界面を形成していた。このアロステリック・メカニズムに基づき、IDL上またはその周辺に変異を導入することで、生化学的アッセイや哺乳類細胞において標的切断活性を維持しながら、コラテラル活性を最小限に抑えた新しいCas13bt3変異体を作製した。
 
 [構造情報] 2023-09-23時点で公開待ち:PDB-8FTI  / EMD-29433; 以下の左右の挿入図はそれぞれFig. 3とFig. 7から引用したCas13bt3のアロステリック活性化における構造の変化と、Cas13bt3の標的RNA切断と非選択RNA切断 (コラテラル活性)のモデル図
 Cas13bt 3   Cas13bt 7
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