[出典] REVIEW "Engineering extracellular vesicles to deliver CRISPR ribonucleoprotein for gene editing" Whitley JA, Cai H. J Extracell Vesicles. 2023-09-18. https://doi.org/10.1002/jev2.12343 [著者所属] U Georgia (USA);本文 17頁

 EVsは、免疫原性が低く、大容量であることから、治療用の分子をデリバリーする担体として期待されている。CRISPR RNPも、EVsの生合成を通じてEVsにカプセル化する手法が実現されたことで、小胞に物理的、化学的、生物学的な操作を加える必要がなくなっている。ジョージア大学の研究チームは今回、CRISPR RNPをEVsにカプセル化する戦略として、それぞれ特徴のある16種類同定し、概観した。カプセル化プロセスを促進する分子メカニズムに従って、遺伝子融合に基づくウイルス様粒子へのCas9 RNPのカプセル化戦略が6種類、タンパク質テザリングに基づくEVへのカプセル化戦略が7種類、sgRNA結合カプセル化に基づくカプセル化戦略が3種類である。

 また、EVの生合成の際に、EVの膜表面に、送達する目標を標的する分子を組み込むことで、トロピズムが付与され、特定の細胞タイプへの送達効率を向上させる戦略も取り上げた。この分子としては、ウイルスエンベロープタンパク質、リガンドペプチドを含む組換えタンパク質、単鎖可変領域フラグメント (scFv) 抗体、インテグリンなどが挙げられる。

 しかし、こうした戦略を臨床試験へと展開するにはまだ限界がある。中でも、Cas9 RNPをカプセル化するためのウイルスタンパク質の組み込みは、宿主の免疫反応による生体適合性の問題を引き起こしている。今後の研究では、ウイルスタンパク質を含まないEVの遺伝子工学的設計、EVの送達特異性の向上、EVに基づく相同性指向性修復の促進を図る必要がある。

 とはいえ、CRISPR RNPのカプセル化技術とトロピズム技術の統合は、遺伝子治療や疾患治療におけるCRISPR RNPのEVsベースの送達にとるべき戦略である。
 
 [図表一覧]
  • FIGURE 1. Encapsulation of Cas9 RNP into EVs. (a) Encapsulation of Cas9 RNP by physical/chemical approaches.
  • FIGURE 2. Features of VLPs encapsulating Cas9 RNP generated by genetic fusion.
  • FIGURE 3. Genetic features of EVs encapsulating Cas9 RNP generated by protein tethering.
  • FIGURE 4. Genetic features of EVs/VLPs encapsulating Cas9 RNP by active participation of sgRNA. 
  • FIGURE 5. Strategies to acquire tropism for EVs-based delivery.
  • TABLE 1. Advantages and disadvantages of Cas9 plasmid DNA (pDNA), mRNA, and Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP) complex for gene editing.
  • TABLE 2. Strategies to encapsulate CRISPR/Cas9 RNP into EVs for delivery.
  • TABLE 3. Advantages and disadvantages of CRISPR/Cas9 RNP encapsulation strategies.
  • TABLE 4. Strategies to acquire tropism by incorporating viral envelope proteins.
  • TABLE 5. Strategies to acquire tropism by incorporating recombinant proteins.
  • TABLE 6. Strategies to acquire tropism by incorporating scFv antibodies or integrins. 
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