[注] DMS法: 網羅的な変異誘発実験に基づく遺伝型と表現型の相関解析に基づいてタンパク質の機能を解析する手法 

[出典] REVIEW "Deep mutational scanning of proteins in mammalian cells" Maes S, Deploey N, Peelman F, Eyckerman S. Cell Rep Methods. 2023-11-10. https://doi.org/10.1016/j.crmeth.2023.100641 [著者所属] VIB Center for Medical Biotechnology, Ghent U；参考文献165件を含む2段組21頁

　

　タンパク質の突然変異誘発実験は、健康、病気、進化におけるタンパク質の機能の根底にある分子機構の同定に不可欠なアプローチである。過去10年間で、突然変異誘発実験の中でも、対象となるタンパク質を構成するほとんどすべてのアミノ酸について1アミノ酸の変化の機能解析を可能にするDMS法が発展してきた。

　DMS法は歴史的には、大腸菌や酵母のような下等生物で開発されてきたが、最近の技術的進歩により、特にヒトの疾病に関与するタンパク質を研究するために、哺乳動物細胞へと適用が広がっている。こうした展開は、臨床現場にて全ゲノム配列決定 (WGS) の急増に伴って大規模に発見されつつある臨床的意義不明のバリアント (ariant of Uncertain Significance: VUS) の分類と解釈に大きく役立つであろう。

　ベルギーの研究チームが今回、哺乳類細胞におけるDMSをベースとする研究の実験的側面を探求し、ワークフローの各ステップで使用される様々な方法を解説する。

 Introduction

　Figure 1 The deep mutational scanning workflow 

　Table 1 Exogenous mammalian deep mutational scanning studies of proteins (non-exhaustive)

　Table 2 CRISPR-based mammalian deep mutational scanning studies (non-exhaustive)
　　Saturation genome editing: Homology-directed repair with repair template library 

　　Saturation prime editing: Prime editing with pegRNA library
　　Base editing with tiling gRNA library: lentiviral transduction gRNA library
　　　at low multiplicity of infection

 Library generation through pooled in vitro mutagenesis

　Oligonucleotide-directed mutagenesis

　Library size

 Library introduction of a single variant per cell

　Epstein-Barr virus (EBV)-derived episomal plasmid transfection and retroviral transduction

　Figure 2 Overview of approaches to generate a library of variants in mammalian cells with
　　　　　one variant per cell

　Site-specific recombination

　Where to land?

 Library generation through large-scale genome editing of the endogenous locus　　

　Saturation genome editing (SGE)

　　challenges with SGE

　Alternative editing methods

　　Base editing

　　Saturation prime editing

 Library screening through functional selection　

 Quantification of variant function by sequencing after selection

　Sequencing challenges

　Sequencing larger variable regions

　Figure 3 Sequencing long variable regions incompatible with Illumina read length

　Barcoded libraries

　　Subassembly of barcoded libraries

　　Long-read sequencing of barcoded libraries

 Data analysis

　Functional score calculation

　Data interpretation

 DMS in the clinic

　Engineering of therapeutic proteins

　Resolving VUSs

 Future perspectives

　Toward the study of larger libraries

　The search for compatible and biologically relevant readouts

　Guidelines for reporting

　Advancing DMS by harnessing single-cell technologies

 Concluding remarks

 Acknowledgments　

 References