2024-10-01 Nature Communications 誌刊行論文の書誌情報、一部詳細な記述、および図一覧を追加
2024-01-09 bioRxiv 投稿に準拠した初稿
[出典] "A split crRNA with CRISPR-Cas12a enables highly sensitive, selective, and multiplexed detection of RNA and DNA" Qiao J, Chen Y, Wang X [..] Liu Y. bioRxiv 2024-01-04 (preprint). Nat Commun 2024-09-27. https://doi.org/10.1038/s41467-024-52691-x [著者所属] 武漢軽工大学, 湖北大学, Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou U and Henan cancer hospital, BravoVax Co Ltd.
2024-01-09 bioRxiv 投稿に準拠した初稿
[出典] "A split crRNA with CRISPR-Cas12a enables highly sensitive, selective, and multiplexed detection of RNA and DNA" Qiao J, Chen Y, Wang X [..] Liu Y. bioRxiv 2024-01-04 (preprint). Nat Commun 2024-09-27. https://doi.org/10.1038/s41467-024-52691-x [著者所属] 武漢軽工大学, 湖北大学, Affiliated Cancer Hospital of Zhengzhou U and Henan cancer hospital, BravoVax Co Ltd.
Cas12aの完全長 (40-nt) のcRNA は、それぞれ固定配列を持つ20-ntのスキャフォールドRNAと可変配列を持つ20-ntのスペーサーRNAを含む2つの部分に人工的に分割することができる。中国の研究チームは今回、Cas12a-crRNA RNPに替えて、Cas12aタンパク質、スキャフォールドRNA、スペーサーRNAに三分割 (split) した因子から、野生型Cas12a RNPに匹敵するトランス切断活性を有する活性型リボ核タンパク質 (RNP) に再構成できることを見出し、SCas12aとして報告した。
SCas12aに高速蛍光アッセイとラテラルフローアッセイを組み合わせることで、前増幅と逆転写を介することなく、miRNAの高感度、選択的、かつ多重な検出が実現し、検出限界 (LoD) は10fMに達した。
- SCas12aによって、二次構造を持たない長鎖RNAの検出も実現された。
- SCas12aによって、成熟miRNAと、それと同じ配列からなるmiRNAの前駆体 (pre-miRNA) の判別も可能になった。これは、正確なバイオマーカの同定と癌の進行のモニタリングに有効な特長である。
- SCas12aはmiRNAに加えてDNAの点突然変異に対する特異性において野生型Cas12aに優った。
- RNAとDNAターゲットの多重検出は、SCas12aに、プール型アクチベータを供給することで実現された。
特筆すべきことに、SCas12aによって、子宮頸癌患者の血漿サンプルからmir-21バイオマーカーの定量が可能になり、RPAを組み合わせることで、臨床サンプル中のヒトパピローマウイルス（HPV）をアトモル濃度の検出するワンポットアッセイも実現した。
結論として、本研究で報告したCas12aシステムにおける「スプリットcrRNA-アクチベーター」は、様々な診断環境において、簡便で費用対効果が高く、しかも強力なSCas12aベースの迅速核酸検出プラットフォームを提供するものである。
[図一覧]
[図一覧]
- Fig. 1: Schematic illustration of the split Cas12a-based assay for the direct detection of miRNA and DNA.
- Fig. 2: Comparison of the nuclease activities between the wild-type Cas12a and split Cas12a RNPs.
- Fig. 3: The real-time fluorescence kinetics of the SCas12a assay for dsDNA and ssDNA targets.
- Fig. 4: Determination of the limit of detection of the SCas12a-based assays for miRNA.
- Fig. 5: Quantitative detection of RNA by SCas12a assay.
- Fig. 6: Detection of miRNA biomarker in clinical samples by SCas12a assay.
- Fig. 7: Specificity of the SCas12a assay towards single point mutations in DNA target
- Fig. 8: Specificity of the SCas12a assay towards single point mutations in miRNA target.
- Fig. 9: Rapid detection of HPV16 using the SCas12a assay.
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