[出典] "Cassette recombination dynamics within chromosomal integrons are regulated by toxin-antitoxin systems" Richard E [..] Mazel D, Loot C. Sci Adv. 2024-01-12. https://doi.org/10.1126/sciadv.adj3498 [著者所属] Institut Pasteur, Sorbonne U, DGA CBRN Defence, U Bordeaux, Viral DNA Integration and Chromatin Dynamics Network (DyNAVir), Roskilde U (Denmark)

  染色体上のインテグロンには数百のサイレントな遺伝子カセットが存在し、インテグラーゼを介した組換えによってDNAの切断と統合が多発し、ゲノムの完全性を脅かす可能性がある。このような大規模なカセット・アレイを維持するために、この活性がどのように制御され、制御されているのか、特に選択圧によって制御されているのかは不明であった。

 フランスを主とする研究チームが今回、プロモーターを含む毒素-抗毒素 (toxin-antitoxin: TA) カセットが、カセット全体の切断率が高すぎる場合に細胞を死滅させるシステムとして重要な役割を果たしていることを発見した。多重化したCRISPRを利用して、inverted SCI内の19個のTAカセットを全て不活性化し、その結果、これらのカセットが死亡する表現型をもたらすことを実証した。

[詳細]

 インテグロンとは、カセットと呼ばれる移動性エレメントを捕獲し、備蓄し、並べ替え、その発現を制御することができる細菌の組換えシステムである。インテグロンが抗菌薬耐性決定基を獲得する遺伝システムであることは、もともと知られていた。インテグロンには、安定プラットフォーム (stable platform) と可変カセットアレイ (variable cassette array) がある[Fig. 1引用右下図 A 参照]。安定プラットフォームは、(i)プロモーターPintの制御下にあるインテグラーゼ遺伝子(intI )、(ii) attI 統合サイト、および (iii)カセットのPcプロモーターによって定義されるIntegron 1

 アレイ中のカセットは一般に、attCと呼ばれる組換えサイトに関連したプロモーターレス遺伝子で構成されている。最初の数個のカセット (Pcプロモーターに最も近いカセット) のみが発現可能で、残りは細胞にとってサイレントで細胞にとって価値ある機能を提示する。これらのカセットは切り離された後、attI統合部位に再統合され、発現するようになる。このようにカセットがシャッフルされることで、細菌は、与えられた環境に対して生存を最適化する機能のセットを用意し、コンビナトリアルな表現型の多様性を確保する。研究チームは以前、カセットのシャッフリングを触媒するインテグラーゼが、ストレス条件下でのみ発現することを発見した [Science 2009]。その後、インテグロン は "オンデマンド "適応システムと呼ばれている [Microbiol Spectr. 2015]。

 インテグロンの安定プラットフォームにおけるインテグラーゼ (IntI) は、チロシンリコンビナーゼの大きなファミリーの中で、非常に特異な位置を占めている。IntIは一次配列を通してattI サイトを二本鎖の形で認識するが、attC サイトは一本鎖の形で組み替える。attC   サイトの二本鎖のボトムとトップの双方が二次構造を形成することができるが、ボトム鎖 (bs) の組換え効率はトップ鎖の組換え効率の約1,000倍である。これにより、attI   部位に組み込まれた際にカセットの正しい向きが確保され、Pcプロモーターによる発現が可能になる。

 研究チームはインテグロンを、接合性プラスミドによって運ばれ、細菌間で動員可能な可動型インテグロン (mobile integron: MI)と、固着型染色体インテグロン (sedentary chromosomal integron: SCI) に分類・比較した。MIが維持するカセットは通常10個未満であるが、SCIは数十個のカセットを含むことが多く、創傷を引き起こすビブリオ・バルニフィカス (Vibrio vulnificus) 由来の最大のSCIは301個のカセットをコードしており、宿主ゲノムのかなりの部分を占めている。

 SCIカセットが帯びている機能は、抗生物質耐性をはるかに超え、細菌の主要な適応機能に関連する無限とも言える多様性を示す。SCIの高い遺伝的能力により、SCIはMIが特定の環境で最も関連性の高いカセットのレパートリーを用意するための、カセットのレポジトリとしての役割を果たすことができる。インテグロン・システムによる目覚ましい適応能力は、SCIとMIのこの複雑なつながりに一因があるが、発見から25年経った今でも、SCIの遺伝子構造は謎めいている。どのような構造が、どのようにして多くのサイレントカセットを蓄積し、バクテリアの中で維持され、将来のストレスに対してこのような適応装置を提供することができるのか、不明である。

 SCIのカセットの中で、毒素-抗毒素 (toxin-antitoxin: TA) 系をコードし、独自のプロモーターを持つ、別個のタイプが注目される。TAシステムは、必須な細胞プロセスを阻害する安定な毒素と、その同族毒素に対抗する不安定な抗毒素をコードする。遺伝子対の発現が停止すると、抗毒素は分解され、細胞死や増殖停止をもたらす。SCIアレイ内にTAシステムが存在することで、大規模な染色体再配列によるカセット欠失が防止され、アレイが維持されると考えられる。しかし、この要因だけでは、巨大なSCIが維持されていることを説明しきれない。

 インテグラーゼが発現するストレス条件下では、カセット欠失率は厳密に制御されなければならない。インテグロン・カセットの蓄積を確実にするためには、カセット切断率はインテグレート率より低く保たれなければならず、大きなインテグロンを維持するためには、2つの率は少なくとも同程度でなければならない。カセット切断率のバランスが崩れると、ほとんどのサイレント・カセットは消失してしまうからである。

 研究チームは今回、TAがカセットに直接関連し、カセット組換えダイナミクスを制御する新たな役割を果たすことを明らかにした。

 現在進行中の第7次コレラ・パンデミックの原因であり、特に巨大なSCI (〜130kb、179カセット) を持つVibrio cholerae N16961株をモデルとして使用した。SCIのカセット・ダイナミクスを集団レベルで測定する遺伝学的アッセイを開発することにより、SCIをその場で「人為的に」反転させる (inverted) と、SCIに沿ってカセット切除率が著しく上昇することを明らかにした。また、インテグラーゼのみが機能している場合、SCIの反転は、高い細胞死亡率と相関する強い成長障害に関連することを示した。CRISPR塩基編集 (Target-AID)を高度に多重化することを介して、反転したSCI内の19個のTAカセットをすべて不活性化することに成功し [前述のFig. 1引用 B 参照]、これらのカセットが観察された死亡率の表現型の大部分を担っていることを証明するに至った。

 こうして得られた結果は、"cassette loss killing"と名付けたインテグラーゼ依存的な機構を介したSCIの維持におけるTAカセットの役割を浮き彫りにした。カセット切断率が高く、大きなSCIの維持が損なわれる可能性がある条件下では、TAカセットも個々のカセットとして高い確率で切断され、その結果細胞が死滅する。Integron 7これによって、TAはインテグロンに選択圧をかけ、カセットの切断率が低く保たれるような配置をとらせる [Fig. 7 モデル図引用右図参照]。このことが、おそらく我々が以前に観察した複製フォークに対するSCIの優先的な配向につながり、カセット切断率を制限していると考えられる。

 インテグロンにおける新たな制御機構が制御ネットワークに加わることで、サイレント・カセットが蓄積・維持され、コンビナトリアルな表現型の多様性を生み出し、将来のストレスに対応できるようになると考えられる。