[出典] "Activation of recombinases at specific DNA loci by zinc-finger domain insertions" Mukhametzyanova L [..] Buchholz F. Nat Biotechnol. 2024-01-31. https://doi.org/10.1038/s41587-023-02121-y [所属] Technical University Dresden
ドイツの研究チームが、条件付き活性化酵素のロジックに基づいて、ジンクフィンガーDNA結合によって編集活性が誘導される「ジンクフィンガー依存性リコンビナーゼシステム」を開発した。このシステムは、リコンビナーゼの正確さとジンクフィンガー・ドメインのDNA標的部位プログラム可能性を兼ね備えている。 研究チームは、このシステムは、これまでのゲノム編集に伴う限界を克服するものとみており、論文出版時点では、共著者の一部が所属しているバイオテクノロジー企業Seamless Therapeutics GmbH社において、幅広い適応症の治療に向けた研究開発が行われる予定とされている。
[詳細]
Cre-loxPシステムを代表とするチロシン部位特異的リコンビナーゼ (Tyrosine site-specific recombinases: Y-SSR) は、広く用いられてきたゲノム編集ツールであり、DNA操作の正確なメカニズムにより治療への展開の可能性を秘めている。Y-SSRは、CRISPR-Casヌクレアーゼと異なり、DNA二本鎖切断 (DSB)を誘発することなく、また細胞のDNA修復機構や補因子に依存することないことから、DNA編集プロセスは予測可能であり、非分裂細胞においても機能する。また、大規模なゲノム配列の切除、逆位、統合、カセット交換などの複雑な操作を実行可能である。
しかし、リコンビナーゼによる組み換えを目的とする遺伝子座を特異的に標的するようにプログラムする手法を別途用意する必要がある。この課題に対しては、リコンビナーゼに外来性のDNA結合ドメインと融合させるアプローチが考えられるが、このアプローチはまだ普及していない。おそらく、活性が低いため、あるいはリコンビナーゼ・ドメインがDNA結合ドメインとは独立して活性を持ち、標的外組換えを引き起こす可能性があるためであろう。
研究チームは今回、DNA結合ドメインが意図したDNA標的部位を認識したときにのみリコンビナーゼが活性化して組換えが進行するように条件付けするアプローチを試みた。この条件付きリコンビナーゼはこれまでに、核内受容体のリガンド結合ドメインに融合することで実現されたが、外来のDNA結合ドメインの活性に依存するリコンビナーゼはまだ報告されていない。
研究チームは今回、DNA結合ドメインが意図したDNA標的部位を認識したときにのみリコンビナーゼが活性化して組換えが進行するように条件付けするアプローチを試みた。この条件付きリコンビナーゼはこれまでに、核内受容体のリガンド結合ドメインに融合することで実現されたが、外来のDNA結合ドメインの活性に依存するリコンビナーゼはまだ報告されていない。
著者らは、Cre型リコンビナーゼにジンクフィンガーDNA結合ドメイン (ZFD) を融合させるところから始めた。リコンビナーゼ認識配列に対するZF結合モチーフの最適な間隔と方向、およびリコンビナーゼとZFD間の最適なリンカー長を定義するために1,700種類の組み合わせを評価し、N末端およびC末端のZF-リコンビナーゼ融合体が組換え活性を最大10倍高めることを見いだした [Fig. 1引用右図参照]。 さらに、ペンタペプチド・スキャニング変異導入法 [Pentapeptide scanning mutagenesis; Nucleic Acids Res, 1997]を用いて、リコンビナーゼをコードする配列内で、ZFDの挿入融合が許容される位置を同定した。注目すべきことに、いくつかのZFD挿入型リコンビナーゼ融合体のリコンビナーゼ活性が、標的配列にZFDが結合すると発揮されることを発見した [Fig. 2: Insertional ZFD fusions generate ZF-dependent recombinase systems参照]。
続いて、ZFD挿入型リコンビナーゼ融合体によって治療可能なリコンビナーゼの特性が改善されることを示し、in silicoで設計されたZFDの特性を改善できる分子進化法を確立した。さらに、ZF依存的に多くの標的部位を組み換えるようにプログラム可能とするマルチラテラル・リコンビナーゼのプロトタイプを開発した。
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