[出典] "Single-molecule assay guided crRNA optimization enhances specific microRNA detection by CRISPR-Cas12a" Chen K, Sun W, Zhong M [..] Wang X, Liu M, Ma X, Ma P. Sens Actuators B Chem. 2024-01-28. https://doi.org/10.1016/j.snb.2024.135389 [所属] 華南師範大学, 上海科技大学, 浙江大学医学院, 深圳农业基因组研究所, 広州医科大学, 上海交通大学医学院
ガイドRNA (crRNA)に誘導されるプログラム可能なCRISPR-Cas12aは、crRNAの標的DNAの認識によって活性化されるそのトランス切断活性の特徴が活かされて、高感度な核酸検出に利用されてきたが、crRNAと標的DNAとのミスマッチが許容されるため、その特異性には限界がある。
中国の研究チームは、1分子アッセイにより、crRNAの長さがcrRNA/Cas12a複合体と標的DNAとの会合動態を制御していることを発見した。すなわち、long-crRNAとCas12aの複合体は、完全にマッチしたDNA標的にも、一塩基ミスマッチのDNA標的にも同程度の速度で結合するが、short-crRNAとCas12の複合体は、一塩基ミスマッチのdsDNAよりも2倍速く標的dsDNAに結合する。この1分子アッセイの結果は、電気泳動移動度シフトアッセイ (EMSA)とdsDNA切断の結果からも裏付けられた。
これらの知見に触発され、研究チームはステムループ増幅共役short-crRNA CRISPR-Cas12a (Stem-loop amplification conjugated short crRNA CRISPR-Cas12a: SlashCas12a) 検出法を確立し、miRNAの検出に応用した。このアプローチでは、短い一本鎖RNAの増幅効率を高めるために、ステムループを介したmiRNA逆転写を利用する。short-RNA Cas12aは、ミスマッチした一本鎖miRNAホモログ、すなわちlet-7aファミリーのメンバーの識別も可能である。
ガイドRNA (crRNA)に誘導されるプログラム可能なCRISPR-Cas12aは、crRNAの標的DNAの認識によって活性化されるそのトランス切断活性の特徴が活かされて、高感度な核酸検出に利用されてきたが、crRNAと標的DNAとのミスマッチが許容されるため、その特異性には限界がある。
中国の研究チームは、1分子アッセイにより、crRNAの長さがcrRNA/Cas12a複合体と標的DNAとの会合動態を制御していることを発見した。すなわち、long-crRNAとCas12aの複合体は、完全にマッチしたDNA標的にも、一塩基ミスマッチのDNA標的にも同程度の速度で結合するが、short-crRNAとCas12の複合体は、一塩基ミスマッチのdsDNAよりも2倍速く標的dsDNAに結合する。この1分子アッセイの結果は、電気泳動移動度シフトアッセイ (EMSA)とdsDNA切断の結果からも裏付けられた。
これらの知見に触発され、研究チームはステムループ増幅共役short-crRNA CRISPR-Cas12a (Stem-loop amplification conjugated short crRNA CRISPR-Cas12a: SlashCas12a) 検出法を確立し、miRNAの検出に応用した。このアプローチでは、短い一本鎖RNAの増幅効率を高めるために、ステムループを介したmiRNA逆転写を利用する。short-RNA Cas12aは、ミスマッチした一本鎖miRNAホモログ、すなわちlet-7aファミリーのメンバーの識別も可能である。
このようにステムループを含むPAMを導入することで、Cas12aのPAMによる制約を超えて、効率的なmiRNA増幅が実現し、miR-122b、miR-21、let-7aなど複数のmiRNAsを効率よく検出と検出限界 7.8 aMを達成した。さらにこのアッセイ法によりmiR-21とlet-7aの異なる発現を同定することで肺腺癌の検出も可能になった。
これらの結果は、適切なcrRNA工学が、特異的分子診断におけるCas12aの応用を拡大することを示している。
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