タイプI-E CRISPR/CasのルーズなPAM認識の構造基盤 : crisp

（創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2016/02/16）CRISPR関連文献メモ_2016/02/16

Corresponding author: Ailong Ke (Cornell U.)
CRISPR/Casシステムの構造と機能解析が精力的に進められてきた中で、タイプI-E　CRISPR/Casシステムについても、例えば、ssDNAに結合したCascade (CRISPR-associated complex for antiviral defence)の結晶構造（4QYZ 挿入図参照）やエンドヌクレアーゼのCas3の結晶構造（＊下記参照）が解かれてきたが、CascadeがPAMを認識する機構が不明であった．また、E. coli のCascadeが５種類のPAM（5’-ATG；AAG；AGG；GAG；TAG）を認識する機構も不明であった．
Ailong Keらは今回、標的の外来二本鎖DNAに結合しているE. coli Cascadeの結晶構造を分解能2.45 Åで決定し、PAMに依存した外来DNAの認識からR-ループ（R-loop）形成に至る分子機構モデルを提唱した．
Cascadeは、二本鎖DNA（dsDNA）状態で5’-ATG PAMをDNAの副溝（minor groove）側から認識する．これはCascadeのサブユニットCse1の構造の３つの特徴（グルタミン・ウエッジ；グリシン・ループ；リジン・フィンガー）に依存している．CascadeのルーズなPAM認識は、DNA副溝の認識が本来的に曖昧なことによって来ると考えられる．
[モデル]
CascadeがdsDNAを走査してdsDNAの副溝側からPAM配列を探索 → PAMの認識/長い滞留時間/dsDNA局所的に折れ曲がり → 最適な副溝相互作用/グルタミン・ウエッジ挿入/プロトスペーサーの最初の２塩基対の破断/DNA融解 → dsDNAのうち標的ストランドの一本鎖DNAとcrRNAの二本鎖形成 → DNAさらに巻き戻し/dsDNAのうち非標的ストランドがCascadeのサブユニットCse2二量体の裏側へと隔離/R-ループ固定 → R-ループ形成はCse1-CTDの回転とCse2二量体のスライドを伴う → Cse1の局所的再配置 → エンドヌクレアーゼCas3のリクルート．

論文→Hayes, R. P. et al. "Structural basis for promiscuous PAM recognition in type I–E Cascade from E. coli ." Nature.Published online 2016 .

構造→5H9F: Crystal structure of E. coli Cascade bound to a PAM-containing dsDNA target at 2.45 Å resolution.

構造→5H9E: Crystal structure of E. coli Cascade bound to a PAM-containing dsDNA target (32-nt spacer) at 3.20 Å resolution.

（＊）（創薬等PF・構造生命科学ニュースウオッチ 2016/02/16）Type Ⅰ CRISPR-Casシステムの構造基盤解明進む

バクテリアとアーケアに獲得免疫をもたらすゲノム上の座位CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)は、9月22日時点のCRISPRdbによると、アーケア150株とバクテリア2,612株において、それぞれ、126株に563カ所と1,176株に3,502カ所が検出されている。獲得免疫は、外来DNAが認識・切断されてCRISPRsの間にスペーサーとして組み込まれ、外来DNAが組み込まれた座位がpre-crRNA (CRISPR RNA precursor)へと転写後にcrRNAへと切断され、crRNAがCas(CRISPR-associated)タンパク質を外来DNAヘ誘導し外来DNAを切断するプロセスを経る。このCRISPR-Casシステムは、プロセスの相違によってI、ⅡならびにⅢの３種類のタイプに分類されている。
タイプⅠでは、Casタンパク質とRNAの複合体であるCascade(CRISPR-associated complex for antiviral defense)が、Cascadeに含まれないCas3タンパク質を活性化して、外来の二重鎖DNAを分解する。2014年８月に、以下の論文リストにあるように、Cascadeの構造とCas3の構造が相次いで報告され、タイプⅠの構造基盤が明らかになってきた。Cascadeの立体構造ならびにcrRNAと外来DNAとの結合様式は、いずれの報告においても、8月7日Scienceオンラインで公開されたJackson等の報告と良く一致していた。すなわち、Cascadeは全体としてタツノオトシゴのような形状であり、11種類のCasタンパク質で保持されたcrRNAは、長さ６塩基の５つのブロックとして外来DNAに対して提示され、ブロックのうち６番目の塩基は外来DNAと結合せず、各ブロックのうち５塩基が外来DNAとリボン状に結合する（すなわち、crRNAと外来DNAは二重螺旋を構成しない）。
【注】今回の典拠論文ならびにPerspectiveは全て2014年8月に刊行された。

Review: CRISPR-Casシステム→Barrangou, R & Marraffini, LA. CRISPR-Cas systems: Prokaryotes upgrade to adaptive immunity.Mol Cell. 014 Apr 24;54(2):234-44.

Perspective: Cascade構造解析→Zhang, Y. & Sontheimer, EJ. STRUCTURAL BIOLOGY: Cascading into focus. Science. 2014 Sep 19;345(6203):1452-1453.

論文→Jackson RN. et al. Crystal structure of the CRISPR RNA–guided surveillance complex from Escherichia coli. Science. 2014 Sep 19;345(6203):1473-1479. Published online 2014 Aug 7.

構造→4TVX: Crystal structure of the E. coli CRISPR RNA-guided surveillance complex, Cascade (分解能 3.24Å)

論文→Mulepati S, Héroux A, Bailey S. Crystal structure of a CRISPR RNA–guided surveillance complex bound to a ssDNA target. Science. 2014 Sep 19;345(6203)1479-1484. Published online 2014 Aug 14.

構造→4QYZ: Crystal structure of a CRISPR RNA-guided surveillance complex, Cascade, bound to a ssDNA target (分解能 3.0303Å)

論文→Zhao, H.et al. Crystal structure of the RNA-guided immune surveillance Cascade complex in Escherichia coli. Nature. Published online 12 Aug 2014

構造→4U7U: Crystal structure of RNA-guided immune Cascade complex from E.coli (分解能 3.003Å)

論文→Huo Y. et al. Structures of CRISPR Cas3 offer mechanistic insights into Cascade-activated DNA unwinding and degradation. Nat Struct Mol Biol. 2014 Sep;21(9):771-7. Published online 17 Aug 2014.

構造→4QQW: Crystal structure of Thermobifida fusca Cas3 (分解能 2.664Å)

構造→4QQX: Crystal structure of Thermobifida fusca Cas3-ATP (分解能 3.34Å)

構造→4QQZ: Crystal structure of Thermobifida fusca Cas3-AMP-PNP (分解能 2.93Å)