[出典] "High-fidelity, hyper-accurate, and evolved mutants rewire atomic-level communication in CRISPR-Cas9" Skeens E, Sinha S [..] Palermo G, Lisi GP. Sci Adv. 2024-03-06. https://doi.org/10.1126/sciadv.adl1045 [所属] Brown U, UC Riverside

 CRISPR-Cas9エンドヌクレアーゼの高忠実度変異体Cas9-HF1 [*1]、高精度変異体 HypaCas9 [*2]、進化型変異体evoCas9 [*3]は、CRISPR-Cas9技術の応用においてオフターゲット効果を軽減するための重要なツールである。これらの変異体において、認識サブドメイン3 (recognition subdomain 3: Rec3) の変異が特異性を媒介する分子機構はよくわかっていない。米国の研究チームが今回、溶液NMR法と分子動力学シミュレーションにより、Rec3における高特異性変異の構造的・動的効果と、それらがCas9におけるアロステリック・シグナルをどのように伝播するかを明らかにした。

 その結果、Rec3において、RNA:DNAヘテロ二重鎖と接する領域に保存された構造変化と動的差異が明らかになり、Rec3から触媒His-Asn-His (HNH)ドメインへと化学シグナルが伝達されることが明らかになった。この変異体では、標的DNAの相補性を感知するとされているRec3のαヘリックス37からの情報伝達が、直接またはアロステリックに再構築されている [Figure 4引用左下図とFigure 5引用右下図参照]。
 REC3 4  REC3 5
この分子機構が、DNAミスマッチを認識するヘリックスとHNH活性部位間の情報伝達を増加させ、Cas9の特異性をもたらす構造とダイナミクスに光を当て、将来の工学的原理に対する洞察を提供する。

[復習:SpCas9の機序]

 CRISPR-Casエフェクターの中で最も広く使用されているCas9酵素であるSpCas9は、His-Asn-Hisエンドヌクレアーゼ (HNH) とホリデイジャンクション・レゾルバーゼC (RuvC) の2つのヌクレアーゼ・ドメイン、Rec3 1PAMと相互作用する (PI) ドメイン、および、3つの異なるサブドメインRec1-3 (図1A) を介して核酸との結合を媒介する認識ローブからなるマルチドメイン構造を帯びている [Fig. 1引用右図 A参照]。

 Cas9はPAM配列を認識すると、局所的に二本鎖DNAをほどき、Cas9に結合したガイドRNA (gRNA)が標的DNA鎖 (TS)とRNA:DNAヘテロ二重鎖を形成する。、続いて、HNHヌクレアーゼとRuvCヌクレアーゼを介して、それぞれTSと非標的鎖 (NTS) の協調的切断が進行する。

 生物物理学的研究と分子動力学シミュレーションによって、Cas9は、触媒HNHドメインの活性化を制御する内因性ダイナミクスによって駆動される複雑なアロステリック反応によって支配されていることが示されている。

 HNHドメインが柔軟であることが適切な位置でのDNA切断を確実にするが、そのコンフォメーション・ダイナミクスは空間的に離れたRec3ドメインの運動に依存することが示され、それゆえRec3ドメインはHNH機能の「アロステリック・エフェクター」とみなされている [2]。このRec3を介した活性化の分子機序の詳細が、これまで、不明であった。

[*] 引用文献と紹介crisp_bio記事
  1. 2017-06-15 SpCas9-HF (1-4):ゲノム編集の精度をさらに向上させるハイファイ(high-fidelity)CRISPR/Cas9 ;"High-fidelity CRISPR–Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects" Kleinstiver BP, Pattanayak K [..] Joung JK. Nature. 2016-01-06/01-28. 
  2. CRISPRメモ_2018/06/08 [第1項] [特許公開] Cas9変異体 (HypaCas9)とその利用法;"Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy" Chen JS, Dagdas YS, Kleinstiver BP [..] Doudna JA. Nature. 2017-09-20/10-19;アロステリック・エフェクタについてはFigure 2 The α-helical lobe regulates HNH domain activation参照 
  3. CRISPRメモ_2018/03/08 [第1項] evoCas9:酵母in vivoスクリーン法を開発し、高い選択性を示すSpCas9変異体を同定;"A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast" Casini A [..] Cereseto A. Nat Biotechnol 2018-01-29/March.