[注文] SSA (single-strand annealing)
[出典] "Verification of CRISPR/Cas9 Activity In Vitro via SSA-Based Dual-Luciferase Reporter System" Deng P, Dong XC, Wang XY, Gao YP, Quan FS. Mol Biol. 2024-03-17. https://doi.org/10.1134/S0026893324700092 [所属] Northwest A&F University (陝西省)
CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集の効率はsgRNAに大きく依存することから、これまでに、sgRNAの切断活性を評価する様々な方法が開発されてきた。中国の研究チームは今回、一本鎖アニーリング (SSA) 修復メカニズムに基づき、ホタルルシフェラーゼを用いたサロゲートレポーターシステムを構築して [Figure 1 Schematic overview of the SSA-based luciferase reporter system 参照]、sgRNAのターゲティング効率を評価した。
具体的には、8種類のsgRNAsを評価し、そのうちの1種類が最も切断効率が高いことを同定することに成功した。このSSAレポーターシステムで得られた精度と感度は、sgRNAsの活性評価法の一つであるT7EI アッセイによる結果と一致し、SSA レポーターシステムは T7EI アッセイと互換性があることが示唆された。
具体的には、8種類のsgRNAsを評価し、そのうちの1種類が最も切断効率が高いことを同定することに成功した。このSSAレポーターシステムで得られた精度と感度は、sgRNAsの活性評価法の一つであるT7EI アッセイによる結果と一致し、SSA レポーターシステムは T7EI アッセイと互換性があることが示唆された。
SSAレポーターシステムは、PCR増幅など複数の工程を必要とするT7EIアッセイに対して、1ステップでトランスフェクション可能であり、大規模なsgRNAsライブラリーでも約2日で完了する優位性を備えている [ Figure 3 Workflow of the T7E1 assay and SSA assay. (a) Timeline of T7E1 assay. (b) Timeline of SSA-based luciferase assay 参照]
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