[出典] "Improving prime editing with an endogenous small RNA-binding protein" Yan J [..] Adamson B. Nature 2024-04-03. https://doi.org/10.1038/s41586-024-07259-6 [所属] Princeton U, Gladstone–UCSF Institute of Genomic Immunology, Boston Children’s Hospital, Dana–Farber Cancer Institute, Harvard Stem Cell Institute, Broad Institute, Harvard Medical School, UCSF, UC Berkeley, Arc Institute, Medical University of Vienna, Parker Institute for Cancer Immunotherapy PEは、PEに特有のガイドRNA (pegRNA) において標準のガイドRNAから伸長された3′末端に配置されたテンプレート配列を逆転写 (RT template)することにより、ゲノムを正確に改変することができる [モデル図参照]。プリンストン大学のBritt Adamsonが率いる研究チームは今回、PEの性能向上をもたらす細胞内在因子を同定することを目的として、
スケーラブルなPEレポーターを開発し、ゲノムワイドCRISPRiスクリーニング [*] を行った [Fig. 1引用右図参照]。その結果、PEの最も強力なメディエーターとして一因子をが浮上した。RNA結合エキソヌクレアーゼ保護因子 La (small RNA-binding exonuclease protection factor La) である。
スケーラブルなPEレポーターを開発し、ゲノムワイドCRISPRiスクリーニング [*] を行った [Fig. 1引用右図参照]。その結果、PEの最も強力なメディエーターとして一因子をが浮上した。RNA結合エキソヌクレアーゼ保護因子 La (small RNA-binding exonuclease protection factor La) である。[*] CRISPhieRmixを利用してヒット遺伝子を同定
続く詳細な解析により、Laは、PEのバージョン (PE2, PE3, PE4, PE5)、編集タイプ (置換、挿入、欠失)、内在性遺伝子座、細胞種を問わずPEを促進するが [Fig. 2参照]、標準的なガイドRNAに依存するゲノム編集アプローチには一貫した効果を示さないことが明らかになった。
これまでに、LaはRNAポリメラーゼIII転写産物の3′末端のポリウリジン鎖に結合することが示されていたことから、今回、Laをポリウリジン化pegRNAに付加することを発想し、3′末端と機能的に相互作用し、安定化することを見出した [Fig. 3引用 左下図 f 参照]。
付加の位置を検討した結果をもとに、PEのC末端にLaのRNA結合N末端ドメイン (1-194)を融合したバージョンPEmax-Cが最適であったことからこれを選択し、PE7と命名した [Fig. 4引用右上図 a, e 参照]。 PE7は、pegRNA, epegRANs, およびLaとの結合に最適化した合成ペグRNAを用いた編集を改善した。
本研究は、PEの構成要素が細胞内環境とどのように相互作用するかについての重要な洞察を与え、また、外来低分子RNAを安定化させるための一般的な戦略も示唆した。
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