[出典] "Protocol to target a promoter region in human embryonic kidney cells using the CRISPR-dCas9 system for single-locus proteomics" Alkhayer R, Ponath V, Pogge von Strandmann E. STAR Protoc. 2024-04-30. https://doi.org/10.1016/j.xpro.2024.103045 [所属] Institute for Tumor Immunology (Philipps U Marburg)
特定の遺伝子の発現を担う転写因子の解析は、目的の部位に存在する量が少ないため、技術的に困難なままである。最近、著者らは、不活性化Cas9 (dCas9) を利用したクロマチンのin situキャプチャーと呼ばれる既述の技術に基づいて、NK細胞活性化リガンドMICA1のプロモーターに関連する潜在的な転写因子を同定した。
MICAのプロモーター領域を標的とするガイドRNA（gRNA）と組み合わせて、この方法を適用して、目的の部位にdCas9を保持し、その後、Cas9抗体を介したプルダウンと、それに続く質量分析とPCRによる結合タンパク質とDNAの解析をそれぞれ行った [グラフィカルアブストラクト引用右図参照]。
MICAのプロモーター領域を標的とするガイドRNA（gRNA）と組み合わせて、この方法を適用して、目的の部位にdCas9を保持し、その後、Cas9抗体を介したプルダウンと、それに続く質量分析とPCRによる結合タンパク質とDNAの解析をそれぞれ行った [グラフィカルアブストラクト引用右図参照]。 [＊]
プロトコルの詳細
"KLF4-mediated upregulation of the NKG2D ligand MICA in acute myeloid leukemia: a novel therapeutic target identified by enChIP" Alkhayer R, Ponath V, Frech M, Adhikary T, Graumann J, Neubauer A, Pogge von Strandmann E. Cell Commun Signal. 2023-05-04. https://doi.org/10.1186/s12964-023-01118-z
本論文はCAPTURE (CRISPR affinity purification in situ of regulatory elements)[*]法を改変したプロトコルを使用した
[*] [＊] 2017-06-26 dCas9ビオチン化によるCAPTURE法を開発し、シスエレメントを捉えた；"In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9" Liu X et al. Cell. 2017 Aug 24;170(5):1028-1043.
プロトコルの詳細
"KLF4-mediated upregulation of the NKG2D ligand MICA in acute myeloid leukemia: a novel therapeutic target identified by enChIP" Alkhayer R, Ponath V, Frech M, Adhikary T, Graumann J, Neubauer A, Pogge von Strandmann E. Cell Commun Signal. 2023-05-04. https://doi.org/10.1186/s12964-023-01118-z
本論文はCAPTURE (CRISPR affinity purification in situ of regulatory elements)[*]法を改変したプロトコルを使用した
[*] [＊] 2017-06-26 dCas9ビオチン化によるCAPTURE法を開発し、シスエレメントを捉えた；"In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9" Liu X et al. Cell. 2017 Aug 24;170(5):1028-1043.
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