[出典] “AcrIIA28 is a metalloprotein that specifically inhibits targeted-DNA loading to SpyCas9 by binding to the REC3 domain” Kim GE, Park HH. Nucleic Acids Res. 2024-05-10. https://doi.org/10.1093/nar/gkae357 [所属] Chung-Ang U

[構造情報] 8K4M (AcrIIA28 structure)  [2024-05-14時点で公開待ち]

　韓国の研究チームが、連鎖球菌のファージJavan 128 由来の抗CRISPRタンパク質 AcrIIA28 の構造とSpyCas9を阻害する機構を明らかにした。

　AcrIIA28はZn²⁺を含む金属タンパク質であり、SpyCas9のREC3ドメインと直接相互作用することにより、SpyCas9特異的に切断活性を阻害することが明らかとなった。さらに、AcrIIA28との相互作用により、標的DNAのCas9にロードが阻害されという機序も明らかになった [グラフィカルアブストラクト引用右図参照]。

[詳細]

　現在、タイプI、II、III、V、VIを含む様々なCRISPR-Casシステムを阻害する100以上の異なる抗CRISPR（Acr）タンパク質が同定されている。特に、32のAcrIIAファミリーが、「セルフターゲッティング」、「機械学習」などの多様な方法論を用いて発見されている。

　AcrIIAタンパク質Cas9を阻害する機構は多様であるが、主に3つの戦略に分類できる： crRNAのローディングの妨害、DNA結合の阻止、DNA切断の阻止である。SpyCas9に対するAcrIIA28の詳細な阻害作用様式を解明するために、ゲルシフトアッセイ (Electrophoretic mobility shift assay: EMSA)を用いて、AcrIIA28のSpyCas9への直接結合が標的DNAのSpyCas9へのリクルートを阻害するかどうかを判定した。

　SpyCas9-sgRNA RNP複合体を標的DNAとインキュベートすると、標的DNAは、RNP/DNA複合体によって生成される可能性のある新たなバンドが検出された。一方で、標的DNAの添加前にAcrIIA28を添加した場合、標的DNAはRNP/DNA複合体バンドは現れなかった。すなわち、AcrIIA28がRNP複合体に結合すると、標的DNAがSpyCas9に結合するのを阻害することが示された。また、AcrIIA28を添加する前に標的DNAをRNP複合体に添加すると、RNP/DNA複合体は依然として生成された。このことから、AcrIIA28は標的DNAがCas9にロードされるのをブロックし、一旦RNP/DNA複合体が実行されると、AcrIIA28はDNAをCas9から強制的に分離させることができないことが示された。

　さらに、in vitro切断アッセイにおいて、標的DNAの前後にAcrIIA28を添加した場合の阻害効果を比較したところ、標的DNAの前に添加した場合に限りAcrIIA28の阻害活性が観察され、EMSAの結果が裏付けられた。