[出典] “CUT-PCR: CRISPR-mediated,
ultrasensitive detection of target DNA using PCR . ” Lee SH, Yu J, Hwang GH, Kim S, Kim HS,4, Ye S, Kim K, Park J, Park
DY, Cho YK, Kim JS, Bae S. Oncogene. 2017 Aug 28. 血中循環腫瘍由来DNA ( ctDNA )が腫瘍特異的バイオマーカーとして注目を集めているが、早期発見のバイオマーカーとして利用するには特に、極めて微量の ctDNA をエンリッチする技術が必須である。 Casタンパク質はPAM を認識してDNA を切断するが、腫瘍細胞特有の変異がPAM 配列を改変しCas9 から逃れるという仮説のもとに、Cas により血中の野生型DNA を切断・除去(バックグラウンドを低減)した後に、標的変異領域をPCR 増幅しディープシーケンシングで同定する手法CUT (CRISPR-mediated, Ultrasensitive detection of Target DNA)-PCR 法を設計(挿入図Figure 1-a 参照)。
はじめに、COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations
in Cancer) データベースに登録された
325,856 種類の腫瘍細胞変異を、PAM 変異を介して検出可能か否かを、それぞれ特有のPAM を認識し互いに直交するCas9 エンドヌクレアーゼとCpf1 についてin silico 解析し、CUT-PCR によってCOMIC 登録癌細胞変異の〜80% を検出可能と見積もった(Fig 1-b/cと 挿入表Supplementary Table 1 参照 )。 続いて、CUP-PCR 法を、野生型遺伝子配列を帯びたプラスミドと腫瘍変異遺伝子配列を帯びたプラスミドを混在させた
in vitro 試験系で評価し、 <0.01% 以上の高感度で変異遺伝子を検出可能なことを確認した。 さらに、ステージ1を含む8名の大腸癌患者と4名の健常者由来血漿中のDNA から CUT-PCR 法によって、腫瘍組織の pyrosequencing よりも精密な KRAS 変異検出が可能なことを確認した(挿入表 Supplementary Table 2 参照)。
CUT-PCRの性能は、互いに直交するエンドヌクレアーゼを加えてPAM を拡張することで向上する。
↑このページのトップヘ
コメント