CRISPR技術によるゲノム編集に伴うオフターゲットの汎用的アッセイ法Tracking-seq : crisp

[出典] [所属] Tsinghua U, Affiliated Yantai Yuhuangding Hospital of Qingdao U, Guilin Medical U

　CRISPR-Casをベースとするゲノム編集ツールは、ゲノム変異による疾患の治療に有望であるが、臨床応用に向けて、その特異性と正確性を徹底的に評価する必要がある。いわゆるオフターゲット編集を実験的に検出する手法としてこれまで、(1) Digenome-seq、SITE-seq、CIRCLE-seqなど、ゲノムDNAを抽出してin vitroで切断する無細胞でのアッセイ法と、(2) GUIDE-seq9、DISCOVER-seq、DISCOVER-seq+など、生細胞内で編集を行うアッセイ法が開発されてきたが、一長一短であった。特定の編集ツールや細胞タイプ用に設計されている、数百万もの細胞を必要とする、偽陽性率が高い、in vitroゲノム編集にしか適用できない、といった課題があった。

　オフターゲット編集を無細胞アッセイやタグを利用するアッセイといった代用 (substitute) 編集システムで評価すると、本来のシステムとは異なるオフターゲット編集を見ることになる可能性がある。ゲノム編集の新たな手法が次々と登場する中、オフターゲット効果を本来のシステムにて直接に検出する普遍的な手法が必要とされている。さらに、ex vivoおよびin vivoゲノム編集では、オフターゲット検出のために数百万個の細胞を提供することはほとんど不可能であり、少量の細胞で十分なアプローチが求められる。これらのニーズに応えるため、清華大学を主とする研究チームは、Cas9、CBE (シトシン塩基エディター)/ABE (アデニン塩基エディター、および、PE (プライムエディター）を含む様々なゲノム編集ツールにおいて、最小限の細胞数でオフターゲット編集を直接検出する汎用性の高い技術であるTracking-seqを開発した。

　Cas9Cas9ヌクレアーゼ (ZNFとTALENも)によるゲノム編集は、DNA二本鎖切断 (DSB)からの細胞内在修復機構に依存し、一方で、CBE/ABEとPEは、DNAの一本鎖切断（SSB) からの修復に依存している。研究チームはここで、ヌクレオチド除去修復、DNAミスマッチ修復、相同組換え、非相同末端接合（NHEJ）など、ほとんど全てのDNA損傷修復プロセスに関与するヘテロ三量体タンパク質複合体である複製タンパク質A (RPA) に注目した。Tracking-seqは、RPAのサブユニットとして広く発現しているRPA2のssDNA結合パターンを認識することにより、標的外部位を検出することで、ほとんどすべての種類のゲノム編集ツールを本来のシステムの中での直接検出を実現した。

　Tracking-seqは主に4つのステップで構成されている [Fig. 1: Tracking-seq: a universal assay for off-target detection via tracking common DNA damage repair protein RPA. の a 参照]：(1) CUT&RUNを用いたRPA結合ssDNAの捕捉、(2) HL-dsDNaseを用いた二本鎖DNA (dsDNA)の除去、(3) 鎖特異的ssDNAライブラリーの構築、(4) Offtrackerを用いた次世代シーケンシング (NGS) とin silico解析

　同一のsgRNAを利用したTracking-seqアッセイにより、ゲノム編集によって誘導されるオフターゲット編集の結果が、Cas9/CBE/ABE/PEの様式や編集対象とされた細胞のタイプに左右されることを、発見した。 [Fig. 5: Heterogeneity of off-target effects when using different genome-editing tools.参照]

　Tracking-seqは、必要とする細胞が少量であり、in vitro, ex vivo, in vivoのいずれのゲノム編集にも適用可能であり、様々なシナリオにおいて、ゲノムワイドかつ高感度なオフターゲット編集を可能にする実用的なツールである。

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