[出典] "Increasing intracellular dNTP levels improves prime editing efficiency" Liu P, Ponnienselvan K [..] Wolfe SA. Nat Biotechnol. 2024-09-25. https://doi.org/10.1038/s41587-024-02405-x [所属] U Massachusetts Chan Medical School.
初代細胞では、細胞内のデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）レベルは細胞周期依存的に厳密に制御されている。UMass Chan Medical Schoolの研究チームは、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ MMLV-RT）の酵素的性質を改善する変異と、細胞内のdNTPレベルを増加させる処理によって、PEの精密な編集率が大幅に改善されることを、発見した。
[詳細]
PEは、標的塩基の変換、欠失、挿入を行う汎用性の高さから、様々なヒト疾患に対する広範な治療応用の可能性を秘めている。PEには3つのコアコンポーネントがある： Cas9ニッカーゼ、モロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）逆転写酵素（RT）、PEガイドRNA（pegRNA）である [右図モデル図参照]。PEの効率は、単一のガイドRNA（sgRNA）を加えて標的鎖へのニッキングを誘導することで向上し（PE3）、編集精度は、pegRNAがコードする配列をニッキングガイドが認識するように誘導することで維持される（PE3b）。これらのPEコンポーネントは、PEの成果を向上させるために最適化が行われてきた。
PE2および改良されたPEmaxシステムでは、5つの変異を帯びたMMLV-RTが使用され、耐熱性、RNA-DNAテンプレートに対する親和性、処理性が向上している。その後の研究では、PEの効率を高めるために、さらなる変異を導入したMMLV、代替RT、DNA依存性ポリメラーゼ、スプリットPEシステム、進化したRTが評価され、精密編集の結果に顕著な改善が見られた。このような進歩にもかかわらず、一部の初代細胞タイプや一部の組織におけるin vivoでの精密編集率はまだ控えめである。
UMass Chan Medical Schoolの研究チームは、初代細胞におけるPEの効率は、MMLV-RTの固有の特性によって妨げられているという仮説を立てた。例えば、これまでのPEのコンポーネントの最適化のほとんどは、急速に分裂する哺乳類細胞で行われてきた。ところが、有糸分裂後の細胞や静止細胞では、細胞内のデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）濃度が、サイクリング中の形質転換細胞の100分の1程度の低濃度である。この希少性がdNTPに対する親和性の低さのためにMMLV-RTの処理性能を抑制している可能性がある。さらに、PEmax PE タンパク質 の精製中に、MMLV-RT 依存的なタンパク質の凝集が観察されたことから、その溶解性がPEの活性を制限している可能性が示唆された。
研究チームは、MMLV-RTの酵素的最適化を事前に行うことで、PEによる編集結果を改善できると想定し、形質転換細胞株（HEK293T細胞およびU2OS細胞）および初代線維芽細胞を用いて、PEmaxのPE活性に影響を与えるいくつかの既知のMMLV-RT配列変異体をスクリーニングした。MMLV-RTは、Q221R変異や223位の様々な変異により、dNTP量が制限される条件下での処理性能が増強される。V223M変異は、MMLV-RTの活性部位をオンコレトロウイルスRTからより効率的なレンチウイルス様RTに変化させ、dNTPに対するKmを2〜4倍減少させる。
PEの編集率を向上させるために、MMLV-RTのV223に様々な変異が導入されてきている。研究チームは、Q221Rと3つの異なるV223変異体（V223A、V223M、V223Y）が、複数の標的部位におけるプライム編集率に及ぼす影響を、エディターレベルの飽和下で個別に評価し、活性の違いを明らかにした。
PEの編集率を向上させるために、MMLV-RTのV223に様々な変異が導入されてきている。研究チームは、Q221Rと3つの異なるV223変異体（V223A、V223M、V223Y）が、複数の標的部位におけるプライム編集率に及ぼす影響を、エディターレベルの飽和下で個別に評価し、活性の違いを明らかにした。
dNTP親和性変異体のうち、V223M（PEmax*）とV223Yはプライム編集率をわずかに向上させ、V223Mは最も大幅な活性の向上を示した [Fig 1 a 参照] 。MMLV-RT の溶解性は、N末端の24 アミノ酸の切断や L435K 変異によって改善されるが、触媒性能には大きな影響はなかった。PEmaxの場合、MMLV-RTのN末端切断はPE編集効率を低下させたが、L435K変異はPE編集効率を著しく向上させた。次に、L435K変異体とPEmaxの各dNTP親和性変異体を組み合わせ、最近Liu研究室によって開発されたPE6d 変異体と、その編集効率を比較評価した。その結果、V223MとL435KのMMLV-RT変異体の組み合わせ（PEmax**）が最も頑健で、PEmaxを平均2.5倍上回り、ターゲット部位のパネル全体でPE6d（1.4倍）よりもわずかに改善されることを、確認できた。
[注] PEmax**の構成
BPSV40 NLS | nSpCas9 (E221K N394K) H840A | Linker | M-MLV(V223M/L435K) | BPSV40 NLS | c-Myc NLS
[注] PEmax**の構成
BPSV40 NLS | nSpCas9 (E221K N394K) H840A | Linker | M-MLV(V223M/L435K) | BPSV40 NLS | c-Myc NLS
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