[出典] "Repurposing an Endogenous CRISPR-Cas System to Generate and Study Subtle Mutations in Bacteriophages" Kamata K [..] Fineran PC. CRISPR J. 2024-09-30. https://doi.org/10.1089/crispr.2024.0047 [所属] U Otago
バクテリオファージの応用には効果的なファージ工学が有効であるが、微妙な改変を施した後に目的の遺伝子型を選択することは依然として困難である。ニュージーランドの研究チームがこの課題を、Pectobacterium carotovorumファージ ZF40において、2段階の内在性CRISPR-Casベースのファージ工学的アプローチにより解決可能なことを示した。
- ZF40に相同な配列とミニCRISPRアレイを帯びたプラスミドを設計し、内在性のタイプI-E CRISPR-Casシステムを利用して、相同組換えを実現し、かつ、非組換えファージゲノムに対するカウンターセレクションを実現した。
- このアプローチでは、標的遺伝子の欠失に続いて、所望の変異を帯びた遺伝子座の復元が進行する。この2段階のプロセスによって、従来のCRISPR-Casによるカウンターセレクションでは配列の識別が不十分であること、プロトスペーサー隣接したモチーフ (PAM)が必要であるため改変できる配列が限定されることなど、ファージの微妙な改変における大きな課題を回避することができた。
- さらに、20bpのバーコードを組み込むことで、混合集団におけるファージ変異体の定量も可能になった。
本研究で確立した手法は、ゲノム配列の差異が小さく類似したファージの混合を対象とする研究や応用に有用である。
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