[20241128更新] TnsABCDトランスポソームの構造から明らかになった標的DNA転位のメカニズム : crisp

2024-11-28 Cell誌冊子体出版の書誌情報とPDBエントリー公開情報を追記
2024-10-16 Cell誌オンライン出版に準拠した初稿
[出典] "Structure of TnsABCD transpososome reveals mechanisms of targeted DNA transposition" Wang S [..] Chang L. Cell. 2024-10-08/11-27. https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.09.023 [所属] Purdue U, U Chicago；グラフィカルアブストラクト Cryo-EM structure of the TnsABCD transposome in the type I-B2 CAST from Peltigera membranacea cyanobiont 210A (PmcCAST)

[構造情報]

EMDB 42941 / PDB 8V32: TnsD-TnsC-DNA complex (3.01 Å)
EMDB 44944 / PDB 9BW1: TnsABCD-DNA transpososome (3.65 Å)

[概要]

　米国の研究チームが今回、CRISPR関連トランスポゾン（CAST）であるPeltigera membranacea cyanobiont 210AのTn7様トランスポゾン（タイプI-B2 PmcCAST）に由来するTnsC-TnsD-att DNA複合体およびTnsABCDトランスポゾームのクライオ電顕構造を再構成し、Tn7様トランスポゾンの典型的な転位経路である、TnsABCDタンパク質を介した標的DNA転位の分子機構を明らかにした。

　これまで実験的に特徴づけられたCASTの中で、タイプI-B2システムはタイプI-Dシステムと密接に関連しており、一方でタイプI-B1システムはプロトタイプのTn7に最も近い。しかし、タイプV-KとタイプI-F CASTはそれぞれ独立に進化し、前者はTnsDを欠き、後者はTnsDを持つ変異型と、持たない変異型に分岐している。DNAの転移には主にトランスポソームの形成が関与する [Figure 7参照]。

　Tn7様トランスポゾンは、宿主染色体に特異的に挿入する能力が特徴である。TnsDによる付着部位（att）の認識は、TnsABCタンパク質をリクルートしてトランスポソームを形成し、トランスポジションを促進する。この経路はよく確立されているが、この過程の原子レベルでの構造的な解明はまだほとんどなされていない。米国の研究チームは今回クライオ電顕法で再構成した構造から、TnsDのアルギニン側鎖がCC/GGジヌクレオチドの段差に挿入され、att DNAが顕著に屈曲することを明らかにした。TnsABCDトランスポソーム構造から、TnsAとTnsBの相互作用と、TnsCがTnsABをリクルートするだけでなく、トランスポソームの構築に直接関与していることを、同定した。これらの知見は、Tn7様トランスポゾンによる標的DNA挿入のメカニズムに関する洞察を提供し、ゲノム編集アプリケーションの精度と効率を向上させることに示唆を与える。

[TnsD誘導経路と非TnsD誘導（RNA誘導）経路の比較]

　本研究で再構成したTnsABCDトランスポソーム構造と、以前に報告したCascade-DNA-TniQ-TnsC構造 [＊]を組み合わせることで、TnsD誘導型と非TnsD誘導型（RNA誘導型）RNA誘導型トランスポジションの構造モデルを作成することができた [Fig. 7 C-F参照]。どちらの経路も、TniQファミリータンパク質をブリッジとして用い、ターゲティング因子とTnsABCをつないでいる。このブリッジはRNA誘導経路ではTniQであり、TnsD経路ではTnsDNTDである。興味深い観察として、TniQとCRISPRエフェクターはDNA上の別々の領域に結合するのに対し、TnsDCTDとTnsDNTDは同じ領域に反対側から結合する。このため、認識配列と挿入部位の間の距離にばらつきが生じる。具体的には、RNA誘導経路では、挿入部位はスペーサー配列の51-57bp下流（PAM配列の86-92bp下流）にあるが、TnsD経路では、挿入部位はatt部位の31-33bp下流にある [Fig 7. G参照]。

　さらに、標的認識部位と挿入部位の間で、TniQ（またはTnsDNTD）とTnsCは、主に静電的相互作用を利用して、配列特異性を持たずにDNAに接触する。これによってDNAは一定の範囲内でスライドすることができ、その結果、挿入部位は固定されるのではなく、様々に変化する。どちらの経路においても、ターゲティング因子は挿入部位の上流で標的DNAを安定化させ、その可動性を抑制し、おそらくトランスポソームのアセンブリー中にTnsC中央孔内でスライドするのを防ぐのに役立っている。ターゲティング因子によるこの安定化がトランスポソームの組み立てに重要な要件であることを提案する。

　興味深いことに、TniQはTnsDと比較して、HTH2ドメインを介したCRISPRエフェクターとの特殊な相互作用を進化させてきた [Fig. S7 C-F参照]。この相互作用の注目すべき点は、PmcCascadeのCas11と係合する疎水性パッチである [Fig. S7 D, E参照]。この特性はTniQでは観察されるが、TnsDでは観察されず、その特殊な進化的適応が強調されている。

　この2つの経路は、効率と特異性も異なっていた。生化学的および大腸菌再構成実験によると、TnsD経路はRNA誘導経路よりも約5倍高い転移活性を持つ。同等の条件下で、TnsD経路の挿入頻度は約5％～10％であるのに対し、RNAガイド経路では1％～2％である。例えば、TnsDCTDはTnsCヘプタマーとさらなる相互作用を形成し、TnsCリングの安定性に寄与している可能性がある。しかしながら、RNA誘導経路はより高い特異性を示し、in vitro転位アッセイでは検出可能なオフターゲット転位は見られなかった。両経路の異なるメカニズムを理解することは、特異性と効率を最適化する上で極めて重要である。

[＊]