[注] PAMPHLET（PAM Prediction HomoLogous-Enhancement Toolkit）
[出典] "PAMPHLET: PAM Prediction HomoLogous-Enhancement Toolkit for precise PAM prediction in CRISPR-Cas systems" Qi C, Shen X, Li B [..] Wang D. J Genet Genomics. 2024-11-08. https://doi.org/10.1016/j.jgg.2024.10.014 [所属] BNU-HKBU United International College, South China U Technology, BGI Research, U CAS, U Copenhagen, STOmics Americas Ltd.
CRISPR-Cas技術は、生物を操作するヒトの能力に革命をもたらした。しかし、その重要なボトルネックの一つが、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列がもたらす制限であり、ひいては、PAMの同定である。実験によるゲノムワイドでのPAMの同定には限界があるため、バイオインフォマティクスでのアプローチが不可欠となっている。しかし、既存のPAM予測プログラムにも、CRISPR-Casシステムにおけるスペーサーの数が限られていたことから、精度が低いという限界があった。この問題に対処するため、著者らは、相同性検索を用いて追加のスペーサーを同定し、スペーサー数を最大18倍まで大幅に増加させる新規パイプラインであるPAMPHLETを開発した。
PAMPHLETは20種類のCRISPR-Casシステムで検証され、18のプロトスペーサーのPAM配列を予測することに成功した。これらの予測は、次世代シーケンシングによるタンパク質-DNA認識パターンを特徴付けるDocMF (DNB-based on chip motif finding)プラットフォーム [*]を用いてさらに検証された。新規Casタンパク質のPAMPHLET予測とDocMF結果の高い一致性は、PAMPHLETがPAM配列予測精度を高め、探索プロセスを迅速化し、CRISPRツールの開発を加速する可能性を示している。
[*] "
DNB-based on-chip motif finding: A high-throughput method to profile different types of
protein-DNA interactions" Li Z, Wang X, Xu D, Zhang D [..] Xu X, Xu C, Jiang Y. Sci Adv. 2020-07-31. [詳細]
新しいCRISPRシステムの同定と特性解析は、確立された実験プロセスとバイオインフォマティクスツールの組み合わせにより、より容易になってきている。 新規なCRISPRシステムの発見には、エフェクタータンパク質、crRNA、およびPAMという3つの重要な構成要素を同定する必要がある。タンパク質の精製、ガイドRNAの設計、PAMのスクリーニングのための実験プロセスは検証済みであり、信頼できる。さらに、バイオインフォマティクスツールを用いて新しいCRISPRシステムを解析・比較し、既知のシステムとの類似点や相違点を明らかにすることで、特性を解析するプロセスも加速している。様々な機能ドメインを持つエフェクタータンパク質は、PSI-BLASTやHHpredさらに、AlphaFoldの高精度タンパク質構造予測機能によって、エフェクタータンパク質の機能解析も加速された。
正規のcrRNAは、リピート配列に挟まれたスペーサーユニットで構成され、RNA分子に典型的なヘアピン構造を形成している。 この二次構造は、MfoldのようなRNAフォールディング・ツールで特徴付けることができる。CRISPR-Casシステムの中には、タイプIIやある種のタイプVバリアントなど、切断活性にトランス活性化crRNA（tracrRNA）が必要なものもあるが、crRNAのアンチリピート配列を非コード領域から検索することで、tracrRNAの位置を特定するツールが存在する。プロトスペーサーの上流または下流に隣接するPAMは、自己と非自己のDNAを区別し、自己免疫を防ぐために不可欠である。
機能的なPAM配列を決定することは、新規CRISPR-Casファミリーの特性評価における律速段階である。これまでの生体内PAMスクリーニング実験は、BGISEQ-500に基づくDocMF（DNB-based on chip motif finding）のようなハイスループットのin vitro PAM決定ツールが利用可能であるにもかかわらず、長時間を要するからである。したがって、PAMスクリーニングプロセスを効率化し、新規CRISPR-Casシステムの特性解析を迅速化するためには、バイオインフォマティクスに基づく（in silico）PAM予測法が望まれる。
CRISPR-Casシステムの適応免疫機構の理解が進むとともに、in silico予測も進んできた。原核生物のこの適応免疫応答は、主に3つの段階で展開される。まず、ファージや外来プラスミドがCRISPR-Casシステムを持つ細菌に感染すると、Cas1とCas2複合体が侵入してくるの小さなDNA断片をCRISPRアレイに組み込み、適応（adaptaion）として知られるプロセスで感染を「記憶」する。その後、CRISPRアレイが転写され、pre-crRNAが、部分的なリピート配列によって挟まれた単一のスペーサーユニットを特徴とするcrRNAへと成熟する。
適応免疫応答の最終的な干渉 (inteference) 段階では、個々のcrRNAがエフェクタータンパク質と会合してcrRNA-エフェクター複合体を形成し、細菌が再び外来DNAに遭遇した際に相補的DNA配列（プロトスペーサー）を標的として破壊する。 タイプI、II、VのCRISPR-Casシステムでは、PAM配列は適応と干渉の両段階において、内在性DNAと異種DNAを区別するために必須である。Casヌクレアーゼが仲介する二本鎖DNA切断（DSB）は、正確なPAM認識に依存している。この特異性は、CRISPR-Cas適応免疫システム内のセーフガードとして機能し、ヌクレアーゼ活性が対応するPAMを持つ外来遺伝要素のみに向けられることを確実にし、宿主ゲノムの望ましくない切断を防ぐ。
CRISPRTarget 、CASPERpam、Spacer2PAMなど、CRISPRアレイからスペーサーを収集し、原核生物ゲノムデータベースからPAMを検索するツールが多数開発されている。これらのツールは、PAMを予測するために主にスペーサー、ウイルスゲノム、プラスミドに依存している。Spacer2PAMは多くの場合、機能的PAMの実験的決定を導く上で優れた性能を示したが、その精度には入力となるスペーサーの質と量が重要であり、CRISPRアレイから得られるスペーサーがわずかな場合、Spacer2PAMや同様のツールの有効性は著しく損なわれる可能性がある。さらに、Spacer2PAMは、アライメントのアクセッション番号を対応する属名や種名に変換するために、Rパッケージのtaxonomizrを必要とする。taxonomizrパッケージは、65GBの容量を占めるSQLデータベースをローカルにダウンロードし、整理する必要がある。
PAMPHLETは、相同性に基づく独自の戦略により、プロトスペーサー予測に利用可能なスペーサーの「量」を拡大することで、PAM予測を強化するPythonパッケージである。この革新的なアプローチにより、PAMPHLETは既存のツールとは一線を画している。既存のツールは、ユーザーが提供する限られた量のスペーサーに依存しているからである。PAMPHLETは、最初のスペーサー入力を相同スペーサーで補強することで、この制限を克服したのである。このアプローチにより、PAMPHLETでは、よりロバストなスクリーニングプロセスが可能になり、PAM予測の精度が大幅に向上し、偽陽性が減少した。さらに、PAMPHLETはローカルのSQLデータベースを必要としないため、ストレージスペースを大幅に節約できる利点もある。PAMPHLETは、エフェクターCasタンパク質の配列と一貫性のあるリピート配列を活用することで、限られたスペーサーデータしか得られない際に、既存のツールが直面する課題に効果的に対処し、正確なPAM予測のためのより信頼性の高い方法を提供する。
実証実験から、PAMPHLETはほとんどのケースでSpacer2PAMを上回り、より厳密で一貫性のある予測を提供することが明らかになった。また、Cas12a（Cpf1）を用いた精密な実験において、PAMPHLETの予測値が、DocMFによるin vitro試験と比較して、よりin vivo実験の結果に近いことが示された。
こうして、PAMPHLETが、PAM予測のためのユーザーフレンドリーで強力なツールであり、また、そのアプローチの革新性と既存のツールに対する実用的な利点が示された。
コメント