[出典] "ReaL-MGE is a tool for enhanced multiplex genome engineering and application to malonyl-CoA anabolism" Zheng W, Wang Y, Cui J [..] Stewart F, Zhang Y, Bian X, Wang X. Nat Commun. 2024-11-12. https://doi.org/10.1038/s41467-024-54191-4 [所属] Shandong U, Tianjin U Science and Technology, Yuelushan Laboratory, Technische U Dresden/U New South Wales.
微生物の代謝工学で遭遇する複雑性が、未だ、代謝工学の予測や設計の障害になっている。これらの複雑性を解明するには、従来の遺伝学を超える戦略が必要である。中国を主とする研究チームが今回、二本鎖（ds）DNAを用いた多重突然変異誘発法を用いて、一本鎖（ss）オリゴヌクレオチドを用いた多重レパトアを拡張するReaL-MGE (Recombineering and Linear CRISPR/Cas9 assisted Multiplex Genome Engineering)を開発した。
ReaL-MGEは、CRISPRが促進する組換え (recombineering) と逆選択 (counter selection)、エキソヌクレアーゼVII（ExoVII）の操作、および複数の直鎖状 (linear) gRNA遺伝子カセットを用いて、dsDNAを用いた多重突然変異誘発を実現する。
ReaL-MGEを利用して、大腸菌、Schlegelella brevitalea およびPseudomonas putida ゲノムへの複数のキロベーススケールの配列の同時挿入に成功し、ReaL-MGEにより、多数の大きなDNA配列の正確な操作が可能なことが実証された。 また、全ゲノム配列決定により、いずれにおいてもオフターゲット変異が誘発されないこと、ひいては、ReaL-MGEによる変異誘発の精度が高いことが確認された。
これら3つのゲノムにおいて、細胞内のマロニル-CoAレベルを増強するReaL-MGEのアプリケーションは、それぞれ26倍、20倍、13.5倍の増加を達成し、それによって標的ポリケチドの収量を1桁以上促進した。
さらにReaL-MGを利用して、S. brevitaleaを、制限された炭素源（藁由来のリグノセルロース）を利用したマロニル-CoAのレベル上昇に適応させ、リグノセルロースからの抗がん二次代謝物エポチロンの生産を実現した。
dsDNAを用いた多重突然変異誘発によって、付加的な機能を完全にコードできる長いセグメントを組み込むことが可能になったが、さらに、dsDNAの生成にPCRを利用することで、柔軟な設計が可能になる。
ReaL-MGEは、HRの効率を改善し、選択マーカーへの依存や複数のgRNA共発現プラスミド構築の困難性などの問題を回避することにより、細菌多重ゲノム工学を大きく発展させた。
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