[出典] "A history-dependent integrase recorder of plant gene expression with single-cell
resolution" Maranas CJ [..] Guizhou S. Nat Commun. 2024-10-30. https://doi.org/10.1038/s41467-024-53716-1 [所属] UW Seattle, Earlham Institute (UK)
発生過程において、ほとんどの細胞は、最終的に完全に分化した成熟状態に至る運命の漸進的な制限を経験する。発生プログラムの根底にある遺伝子発現パターンをより深く理解することは、新しい形態や最適化された形態のための工学的努力に役立つ。著者らは今回、4状態のインテグラーゼを用いた遺伝子発現履歴の記録装置を紹介し [Fig. 1引用左下図参照]、シロイヌナズナの側根形成 [Fig. 2引用右下図参照] と気孔分化という2つの発生過程における遺伝子発現事象の追跡におけるその利用法を示した。
この記録装置は、2つのセリンインテグラーゼを用いて、DNAの連続的な組換え現象を仲介し、その結果、蛍光レポーターの発現が段階的に、履歴に依存して切り替わる [Fig. 1引用左上図参照]。インテグラーゼの発現を促進するために、2つの分化経路のそれぞれで異なる時期に発現するプロモーターを用いることで、蛍光の状態を発生軌跡に沿った遺伝子発現の秩序だった進行と結びつける。成熟した組織の1回のスナップショットで、われわれの記録装置は、過去の遺伝子発現を単一細胞の分解能で明らかにすることができる。このようにして、気孔の発生における不均一性を捉えることができ、分化の2つの代替経路の存在を確認することができる。
[詳細]
発生過程における遺伝子の連続的な発現は、細胞の運命を徐々に制限し、特定する。細胞分化過程に関与する遺伝子の多くは、モデル生物および非モデル生物の多くで同定されており、多くの場合、これらの遺伝子は細胞運命パスウェイとして組み立てられている。しかし、発生を完全に理解するためには、これらの遺伝的制御ネットワークの確立と、これらのネットワークが個々の細胞でどのように経験されるかという変異の程度と影響に関する情報を組み合わせる必要がある。この目的を達成するための重要な制限技術は、空間的情報を維持する単一細胞分解能で遺伝子発現履歴をモニターする方法である。
既存のscRNAseq技術は、様々な文脈において豊富な遺伝子発現データを提供する。しかし、scRNAseqでは、ある時点における細胞の転写状態のスナップショットしか得られず、低発現遺伝子の発現を捉えることができず、またサンプルを破壊する必要があるため空間分解能が損なわれる。最近、scRNAseqと付加的な技術（mRNAの代謝標識、mRNAのスプライス状態の評価、擬似時間解析 [*]など）を組み合わせた方法が開発され、ある程度の時間的情報を推測できるようになり、Zea maysやArabidopsis thaliana における細胞仕様の研究に応用されている。
[*] 擬似時間（pseudotime）: 任意の単位で表される数値であり、特定の細胞が対象となる動的プロセスの中でどの程度の距離にあるかを示す [*1]。
scRNAseqからより多くの情報を得るための別のアプローチとして、哺乳類や植物の系における次世代シーケンサーと組み合わせたポジショナルバーコーディングや、哺乳類や植物におけるin situ蛍光ハイブリダイゼーションと組み合わせたin situシーケンサーなど、空間情報を追加する取り組みがある。
このようなアプローチでは、空間的な状況はある程度わかるが、時間的な情報は得られず、かなり高価で複雑である。あるいは、空間的・時間的情報を保持したまま、遺伝的事象のマーカーとして蛍光発現を利用する方法が、マウスモデルや植物を含む多様な生物で数十年にわたって広く用いられてきた。これらのアプローチは、一度に使用できる蛍光タグの数に限りがあること、繰り返し照射することによる生物へのストレス、半減期が長いこと、成熟時間が遅いこと、蛍光タンパク質の光退色リスクがあることなどから、情報量に限界がある。ある先行研究 [*2] では、シロイヌナズナの側根発生を研究するために、蛍光ベースのライブイメージングアプローチを複数日にわたって実施したが、イメージングセットアップが複雑であったため、追跡できたのはわずか6個体であった。
近年、DNAベースの記録システムが開発され、'omic'や顕微鏡ベースの技術の課題のいくつかを克服している。
CRISPR-Cas9を介した変異とそれに続くDNA配列決定に基づくシステムは、哺乳類細胞におけるWntシグナル伝達経路の記録を可能にした。CRISPRを利用したDNAベースの記録装置は、例えば、シロイヌナズナ組織における系統の再構築、ゼブラフィッシュ臓器、系統追跡マウス系統の開発 [*3] など、系統追跡にも利用されている。研究者たちはまた、インテグラーゼのDNA組換え能力を、同様のDNAベースの記録アプローチに利用してきた。例えば、Cre-LoxPシステムは、シロイヌナズナの葉茎と木部の脈管細胞系譜を追跡するために用いられている [*4]。他の研究では、確率的インテグラーゼ組み換えを用いてバーコードを生成し、それをマウスの細胞株やショウジョウバエの細胞系譜を構築するためにデコンボリューションしている [*5]。最近、組織特異的インテグラーゼ発現を利用した合成メモリースイッチが、シロイヌナズナで実装された[*6, 7]。さらに複雑なインテグラーゼ回路が設計され、細菌細胞 [*8-10]、哺乳類細胞 [*11, 12]、植物プロトプラスト [*6, 12] で実装されている。
植物は生涯を通じて新しい器官を生み出し続けるため、分化プロセスを研究する上で特に興味深い生物である。また、植物の発生プログラムを解読することは、気候変動によって加速する環境ストレスに適応するために、より優れた特性を持つ新しい作物を工学的に作出することにも役立つ [*13]。
米英の研究チームが今回、 Nicotiana benthamiana でプロトタイプ化され [*14]、シロイヌナズナ [*22] で実装された単一セリンインテグラーゼスイッチを用いた以前の研究を基に、側根形成の基礎となる遺伝子の発現を追跡する記録装置を開発した。
細菌細胞で以前に設計された記録装置 [*10] の論理に従い、シロイヌナズナで4状態の履歴依存性インテグラーゼに基づく遺伝子発現記録装置を設計した。まず、2種類のセリンインテグラーゼを構成的に発現させ、レコーダーターゲットの設計を検証した： PhiC31とBxb1である [先のFig. 1引用図参照]。次に、側根の発生と気孔の形成という、よく知られた2つの転写の軌跡を記録する回路の有効性をテストした。どちらの場合も、個々の細胞における2つの遺伝子の発現順序を捉えることができた。さらに、この記録装置は、成熟した気孔の遺伝子発現履歴に不均一性があることを明らかにし、気孔が経験した別の分化経路を浮き彫りにした。
[引用文献]
- "Computational methods for trajectory inference from single-cell transcriptomics" Cannoodt R, Saelens W , Saeys Y. Eur J Immunol. 2016-09-28. https://doi.org/10.1002/eji.201646347
- "Rules and self-organizing properties of post-embryonic plant organ cell division patterns" von Wangenheim D [..] Stelzer EHK, Maizel A. Curr. Biol. 2016-02-22. https://doi.org/10.1016/j.cub.2015.12.047
- [20200516更新] シングルセルから細胞系譜と転写プロファイルを同時に読み取れるCRISPR/Cas9マウス系統を樹立；CARLIN (CRISPR Array Repair LINeage tracing)マウス https://crisp-bio.blog.jp/archives/20470456.html
- "Bifacial cambium stem cells generate xylem and phloem during radial plant growth" Shi D, Lebovka I, López-Salmerón V, Sanchez P, Greb T. Development 2019-01-09. https://doi.org/10.1242/dev.171355
- 2021-04-17 合成テジタル記録システムを介した細胞系譜の組織内可視化を実現 https://crisp-bio.blog.jp/archives/26083067.html
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- "Hierarchical composition of reliable recombinase logic devices" Guiziou S, Mayonove P, Bonnet, J. Nat Commun 2019-01-28. https://doi.org/10.1038/s41467-019-08391-y
- 2017-04-27 細胞応答を記録しかつ制御可能とするDNAレジスターの開発 https://crisp-bio.blog.jp/archives/1702699.html
- "Rational programming of history-dependent logic in cellular populations" Zúñiga A, Guiziou S [..] Bonnet J. Nat Commun. 2022-09-21. https://doi.org/10.1038/s41467-020-18455-z
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- "A memory switch for plant synthetic biology based on the phage ϕC31 integration system" Bernabé-Orts JM [..] Orzaez D. Nucleic Acids Res. 2020-04-06. https://doi.org/10.1093/nar/gkaa104
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