[NEWS & VIEWS] プライム編集 (PE) と部位特異的インテグラーゼの組み合わせによる大きな遺伝子ペイロードの統合 : crisp

[注] PASTE: Programmable addition via site-specific targeting element

[出典] News & Views "Integration of large genetic payloads using prime editing and site-specific integrases" Gao Z, Bak RO. Nat Protoc. 2024-12-15. https://doi.org/10.1038/s41596-024-01094-9 [所属] Guangzhou Medical U, Aarhus U

　CRISPR-Cas技術は、遺伝暗号の標的操作に革命をもたらした。しかし、遺伝病の治療に向けた大きなブレークスルーとして期待されたものの、Casエンドヌクレアーゼによって生成されるDNA二本鎖切断（DSB）の望ましくない結果は、第一世代のCRISPR-Casツールのアキレス腱であり、治療への応用に安全性の懸念をもたらしている。ベースエディターやプライムエディターのような第二世代のCRISPR-Casツールは、標的とするDNA鎖の一方にのみニックを生成するため、このような有害事象を低減し、単一の患者特異的変異体や小さな変異ホットスポット領域のより安全なゲノム編集を可能にする。しかし、全長遺伝子をコードするキロベースサイズの断片をゲノムに組み込むことはできない。

　部位特異的でDSBに依存しない、大規模な遺伝子配列を統合する方法に対する未だ満たされていないニーズに応えるため、Gootenberg、AbudayyehたちはPASTEの包括的なプロトコルをNature Protocolsに発表した [＊1]。PASTEは、プライムエディターとラージセリンリコンビナーゼ（LSR）の連続的な作用によって機能する。LSRには、PASTEで使われるBxb1を含むDNAインテグラーゼファミリーが含まれており、付着部位として知られる2つのDNA配列間の部位特異的組換えを促進する。この組換え機構は、細胞のDNA修復機構とは無関係であり、遊離DNA末端の露出を回避するため、望ましくないDNA修復イベントのリスクを排除する。PASTEは、インテグラーゼの結合部位を部位特異的に設置するプライムエディター（PE）に依存している。その後、インテグラーゼは、その結合部位と、同種の結合部位を持つ外部から供給されたDNA供与体との間の組換えを触媒し、供与体DNAの部位特異的かつ方向性のある統合をもたらす [News & Views Fig. 1 a参照]。PASTEを用いると、779bpから36kbまでのDNAカーゴが、さまざまなヒト細胞のゲノム遺伝子座に5-50％の頻度で挿入されることが実証されている [＊2]。インテグラーゼはPEと融合しているため、これら2つのコンポーネントを連続的に送達する必要がなく、実験的な使用が簡便である。さらに著者らは、LSRの直交性を利用することで、遺伝子を多重統合するためのアタッチメント部位変異体ペアを作製し、同一細胞内の3つのゲノム部位に3つの導入遺伝子を同時に挿入することを可能にした。

　ツインプライム編集（TwinPE）と呼ばれる最適化されたプライム編集戦略とBxb1インテグラーゼの組み合わせに基づいて、PASSIGE（プライム編集支援部位特異的インテグラーゼ遺伝子編集） [＊3]と呼ばれるほぼ同じ戦略がLiuらによって発表された。TwinPE [＊4] は2つのpegRNAを用い、逆転写後、相補的なDNAフラップを反対鎖上に生成し、部分的にアニールし、DNA修復後、2つのDNAニックの間の配列を置換する [Fig. 1 b 参照]。哺乳類細胞でTwinPE（デュアルフラッププライム編集とも呼ばれる）を行うための詳細なプロトコールも最近発表された [＊5]。別のプラスミドにコードされたBxb1（したがってPEに結合されていない）を同時に導入することにより、5.6kbのDNAエレメントが最大7％の頻度で統合されることが実証された。Liuのグループは最近、Bxb1インテグラーゼを進化させ操作することにより、eePASSIGEと呼ばれる新しいシステムで、8.8 kbのDNA配列を最大46％の頻度で統合できることを示した [＊6]。重要なことは、eePASSIGEは新しいプライムエディター酵素であるPEmaxとPE6も利用していることである。最近発表されたPE7は、PASTEとPASSIGEの両技術の効率をさらに向上させる可能性がある [＊7]。

　PASTEとPASSIGEの全体的な違いは、インテグラーゼがテザーであるかテザーでないかであるが、どちらのシステムもシングルまたはデュアルフラップのプライム編集を利用することができ、異なるPEと異なるインテグラーゼの変異体が関与している。これまでのところ、優れたアーキテクチャはまだ特定されておらず、新しい遺伝子座ごとのDNA統合アプローチを開発するために、さまざまな構成のスクリーニングが奨励されている。

　初代ヒトT細胞のような治療上重要な細胞では、PASTEは1kbの遺伝子カーゴを統合するのに5％程度の統合頻度しか得られない。この細胞タイプでは、古典的なDSBベースの相同性指向性修復（HDR）に基づく最適化された方法を用いて、2.7kbの遺伝子カセットを挿入するのに85％まで達成されている [＊8]。しかし、HDRが高度に抑制されている完全休止期の肝細胞では、PASTEは5％の統合率を達成しており [＊2]、これは注目に値する。PASTEのもう一つの画期的な特徴は、大きな遺伝子カーゴの統合を可能にすることである。逐次HDR戦略では5.7kbまでの挿入が示されているが [＊9]、挿入が長くなるとHDR頻度は低下する。重要なことは、PASTEの効率がドナーのサイズに大きく依存しないことで、36kbのドナーの統合に15％の統合頻度で成功している [＊2]。

　PE／インテグラーゼ戦略の最も顕著な利点はDSBを回避することであるが、それでもオフターゲット効果や意図しないオンターゲット編集がプライム編集で起こることが示されている。さらに、インテグラーゼの中には、ゲノム中の擬似サイト間の組換えを誘発し、染色体再配列を引き起こすものもあることが示されている。PASTEではこのようなことは観察されなかったが、Liuと共同研究者らはeePASSIGEで非常に低い頻度で標的外統合を観察した。このようなオフターゲット統合は、臨床への応用に関して注意深く研究されなければならないが、インテグラーゼのさらなる分子工学的操作や、ヒト細胞との適合性に優れた新規LSRを発見するための現在進行中の努力によって軽減されるかもしれない。PASTEとPASSIGEのもう一つの本質的な課題は、小さな残存DNA配列（アタッチメントハーフサイト）が残ることである [Fig. 1参照]。これとは対照的に、HDRベースの統合は傷跡が残らず、正確な統合が可能である。

　最近発表された別のプロトコールでは、競合技術であるCRISPR-associated transposases（CASTs）を用いた、RNA誘導によるDNAのトランスポジションによる統合に関するガイドラインが示されている [＊10]。CASTはPASTEやPASSIGEと同様の利点を提供するが、哺乳類細胞における効率の低さが課題である。原理的には、これらの技術はすべて、サイズの制約からこれまでの技術では不可能であった、非コード制御エレメントさえ含む可能性のある、大きな全遺伝子リーディングフレームのプログラム可能な挿入を可能にする。大きなリーディングフレーム全体にバリアントが散在し、対立遺伝子の不均一性が大きい遺伝性疾患は、これらの新しい技術から特に恩恵を受ける可能性がある。さらに、これらのツールは、がん抗原を標的とする合成レセプターと、武装化（armoring）サイトカインや免疫クローキングエレメントを組み合わせたような、複数の所望の導入遺伝子を持つ複雑な同種細胞療法の設計能力に革命をもたらすかもしれない [＊11]。

　PEとインテグラーゼの組み合わせは、より安全で効率的な方法で部位特異的な大DNA統合を達成するための重要な技術的進歩を構成し、より洗練された遺伝子治療を患者に提供するためのトランスレーショナルな開発の機会をもたらす。

[引用論文またはcrisp_bio記事]