DNAプラスミドは、細胞培養実験においてRNAやタンパク質の送達や発現に不可欠なツールである。プラスミドの調製には通常、バクテリアによるクローニング、バリデーション、精製といった手間のかかるプロセスが必要である。発現プラスミドを設計し、受託製造業者に注文することは可能であるが、大量のプラスミドが必要な場合、コストが法外になることがある。Harvard Medical Schoolの研究チームは今回、トランスフェクションに適した発現エレメントを含む環状化DNAをわずか3時間で生産できる効率的な全合成法を開発した。
このプロトコルでは、直鎖の二本鎖DNA断片をコンパクトで細菌バックボーンを含まない環状DNA発現ベクター（Circular Vector, CV）に、わずか3時間で環状化・精製する [オリジナル論文Fig. 1引用右図参照]。 プロトコル論文では、CRISPR-Cas9をベースとする塩基編集 (CBEとABE）およびプライム編集（PE）のためのgRNAエレメントをコードするdsDNAテンプレートの設計ガイドと、gRNA発現CVを効率的に調製するためのステップバイステップの手順を提供する。
迅速な調製に加え、このプロトコールで作製されたCVは、コンパクトなサイズ、バクテリアのバックボーンがないこと、バクテリアのエンドトキシンがないこと、バクテリアのRNAやDNA断片によるコンタミネーションがないことなど、いくつかの重要な利点がある。
これらの特徴により、gRNA発現CVはプラスミドベースのgRNA発現テンプレートよりも優れた選択となる。
事実、プライム編集（PE）におけるガイドRNA（pegRNA）を発現させた CVを適用し、直鎖状プラスミドで発現させたガイド [＊]と比較して、この方法が同等、あるいはそれ以上の性能を持つことを実証した [オリジナル論文Table 1引用右図参照]。
事実、プライム編集（PE）におけるガイドRNA（pegRNA）を発現させた CVを適用し、直鎖状プラスミドで発現させたガイド [＊]と比較して、この方法が同等、あるいはそれ以上の性能を持つことを実証した [オリジナル論文Table 1引用右図参照]。[＊]
[出典]
- プロトコル論文 "Circular Vectors as an efficient, fully synthetic, cell-free approach for preparing small circular DNA as a plasmid substitute for guide RNA expression in CRISPR-Cas9 genome editing" Oliynyk RT, Church GM. Nat Protoc. 2025-02-24. https://doi.org/10.1038/s41596-024-01138-0
- オリジナル論文 "Efficient modification and preparation of circular DNA for expression in cell culture" Oliynyk RT, Church GM. Commun Biol. 2022-12-21. https://doi.org/10.1038/s42003-022-04363-z
[著者所属] Harvard Medical School (Dept Genetics), U Auckland (Dept Computer Science), Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard U
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