タイプI-ECRISPR-Casシステムは、原核生物において最も広く研究されているRNA誘導型適応免疫システムの一つである。典型的なタイプI-Eシステムにおいては、サブユニットのCas3が漸進的なDNA切断を担っている [crisp_bio 2025-03-04]。一方で最近、cas3を欠失し、HNHヌクレアーゼドメインがCascadeの異なるサブユニット (cas5)に挿入されたCascadeシステムが、正確なDNA切断を可能にすることが報告された [crisp_bio 2023-12-23]。
中国の研究チームは今回、そのCandidatus Cloacimonetes bacterium Cas5-HNH/Cascade複合体の、DNAと結合した状態と結合していない状態の両方の構造を、数種類の原子レベルにクライオ電顕法で再構成し、 Cas5-HNH/Cascade複合体が標的DNAを切断する分子機序を明らかにした。
- 構造解析の結果、HNHドメインとCas6およびCas11を含む隣接するサブユニットとの間に広範な相互作用があり、これらの重要な相互作用に変異があると酵素活性が著しく損なわれることが明らかになった。
- DNA結合状態では、標的鎖がHNHドメインに挿入された構造が得られたが、非標的鎖の密度は不明であり、PAM認識部位の近傍には6-7塩基対の二本鎖DNAしか見えなかった。
- 標的DNAに結合すると、Cas5-HNH/Cascade複合体は非結合状態よりもコンパクトなコンフォメーションをとり、標的DNAの5'末端が顕著にUターンし [論文Fig. 1 i. 参照]、Cas6のβストランドと平行に整列し、Zhangらによって報告された構造と一致してHNHドメインに侵入する [crisp_bio 2025-02-21] 。
- 興味深いことに、二本鎖DNAに結合すると、Cas5-HNH複合体はまず標的鎖を切断し、次に非標的鎖を切断する。これは、Cas12aのRuvCドメインで観察された切断順序とは逆である。
- Cas5-HNHドメインそのものが、Cas5-HNH/Cascade複合体のヌクレアーゼ活性において重要な役割を果たしており、HNHドメインの重要な残基、特にヒスチジンとアスパラギン酸に変異が生じると、切断活性が完全に消失する
- さらに、Cascade複合体は、セシウム、コバルト、ニッケル、亜鉛などの二価の陽イオンに感受性があり、これらの陽イオンは主にカスケード複合体を不安定化させることも明らかになった。
本研究は、これまで特徴づけられてきたタイプI CRISPR-Casシステムとは異なるHNHヌクレアーゼドメインの制御と活性化に関する知見を提供した。
[出典]
論文 "Structural basis for RNA-guided DNA degradation by Cas5-HNH/Cascade complex" Liu Y, Wang L, Zhang Q, Fu P [..] Zhang H, Zhu H. Nat Commun. 2025-02-04. https://doi.org/10.1038/s41467-024-55716-7 [著者所属] Institute of Physics CAS (Beijing National Laboratory for Condensed Matter Physics), U CASTianjin Medical University (Dept Biochemistry and Molecular Biology, Dept Pharmacology).
ニュース "CRISPR system variant shows a novel DNA cleavage mechanism" 中国科学院. 2025-02-14 https://phys.org/news/2025-02-crispr-variant-dna-cleavage-mechanism.html
構造情報
- EMD-61880/PDB 9JXS: Cryo-EM structure of Cas5-HNH Cascade bound with dsDNA (2.93 Å)
- EMD-60328/PDB 8ZP7: Cryo-EM structure of Cas5-HNH Cascade bound with sDNA, Conf1 (3 Å)
- EMD-60330/PDB 8ZP9: Cryo-EM structure of Cas5-HNH Cascade bound with sDNA, Conf2 (2.8 Å)
- EMD-60233/PDB 8ZLU: Cryo-EM strcuture of Cas5-HNH Cascade,Conf1 (2.47 Å)
- EMD-60235/PDB 8ZM3: Cryo-EM strcuture of Cas5-HNH Cascade,apo-Conf2 (3.1 Å)
- EMD-60297/PDB 8ZOL: Cryo-EM strcuture of Cas5-HNH Cascade,Conf3 (2.55 Å)
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