蛍光標識したsgRNAを使用するCRISPR-dCas9をプラスミドで送達することでゲノムを可視化するアプローチは、さまざまな目的に向けた単一および多重なゲノム遺伝子座の動態の分析を可能にした。その一方で、核内プローブの非特異的な蓄積によって精度が低下し、細胞核内に偽陽性のフォーカス（foci）が生成される可能性が指摘されている。
北京大学の研究チームが今回、プラスミド媒介偽陽性フォーカス形成の背後にあるメカニズムを調査することを目的として、dCas9の存在下と非存在下で、sgRNA発現プラスミド、そのRNA転写産物、およびいくつかのRNA結合タンパク質の細胞内局在を調べた。
その結果、偽陽性フォーカスは、これまで推測されていたようにsgRNAの非特異的蓄積から生じるのではないことが明らかになった。代わりに、それらは、研究者が設計したプロモーター遺伝子カセット（gRNAスキャフォールドの設計またはRNAアプタマーまたはオリゴヌクレオチドをベースとするプローブ）以外のプラスミドDNA領域内で発生する偽の転写活性から生じる、
これまで説明されていなかった（cryptic/クリプティック）潜在的なプラスミド転写産物に起因することが明らかになった [グラフィカルアブストラクト引用右図参照]。
これまで説明されていなかった（cryptic/クリプティック）潜在的なプラスミド転写産物に起因することが明らかになった [グラフィカルアブストラクト引用右図参照]。 クリプティック転写物は、その産生プラスミドの周囲に蓄積されるのではなく、パラスペックル・タンパク質 FUS、SFPQ、PSPC1 と相互作用し、核内構造体として隔離される。ただし、この核内構造体は、パラスペックルRNAスキャフォールドのノンコーディングRNAであるNEAT1_2とは相互作用せず、球状性、融合能、1,6-ヘキサンジオールに対する感受性など、液体のような特性を示す。
これらの発見に基づいて、偽陽性シグナルの生成を最小限に抑えるための、簡単に適応できる戦略が提示された。プラスミドバックボーンを欠くsgRNA転写ユニット（sgRNA発現カセット）をトランスフェクトすると、偽陽性信号が減少し、ゲノム可視化の精度が向上した。
本研究は、これまで説明されていなかったクリプティック・プラスミド転写物の存在と由来を明らかにし、蛍光標識sgRNAを実装するCRISPRベースの可視化システムの精度を向上させる可能性のある、簡便なアプローチを提示した。
[出典] "Spuriously transcribed RNAs from CRISPR-sgRNA expression plasmids scaffold biomolecular condensate formation and hamper accurate genomic imaging" Mao S, Wu R [..] Chen AK. Nucleic Acids Res. 2025-03-22. https://doi.org/10.1093/nar/gkaf192 [著者所属] Peking U (Dept Biomedical Engineering, Beijing Advanced Center of RNA Biology, National Biomedical Imaging Center)
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